1、弓形蟲是細(xì)胞內(nèi)寄生蟲，能感染大多數(shù)哺乳動(dòng)物。弓形蟲感染畜禽，可使妊娠家畜受到嚴(yán)重威脅，尤其給豬、牛、羊飼養(yǎng)業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。由于臨床上弓形蟲病缺乏特異性臨床癥狀和體征，診斷仍是弓形蟲病防治中一個(gè)突出的問題。目前，臨床上常用、也是目前我國衛(wèi)生部門推薦的，還是血清學(xué)檢測方法。但其仍存在一些問題，如出現(xiàn)交叉反應(yīng)，又多受機(jī)體免疫狀態(tài)以及方法本身敏感性和特異性的影響，容易出現(xiàn)誤診和漏診。同國外的一些試劑盒相比，目前我國還缺少令人滿意的試劑盒。

2、診斷試劑盒中存在的一個(gè)主要問題是包被抗原的純度或抗原活性不夠，導(dǎo)致檢出的準(zhǔn)確率不高，為此，我們探討利用SAGⅠ體外表達(dá)產(chǎn)物作為抗原建立弓形蟲ELISA診斷試劑盒的可行性，并進(jìn)行了臨床上應(yīng)用，取得了較好的結(jié)果。同時(shí)本研究還建立了弓形蟲的PCR診斷方法，并初步應(yīng)用于臨床檢測。 1.弓形蟲聚合酶聯(lián)反應(yīng)(PCR)方法的建立和初步應(yīng)用：通過對(duì)弓形蟲各種抗原性的比較，選擇SAGⅠ基因中比較保守的一段序列設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，擴(kuò)增出長度為270bp

3、的片段，建立了檢測弓形蟲病的PCR診斷方法，并對(duì)該方法的靈敏性和特異性進(jìn)行了研究：將蟲體個(gè)數(shù)計(jì)數(shù)后提取模板DNA進(jìn)行PCR，結(jié)果表明當(dāng)稀釋到相當(dāng)于0.85個(gè)蟲體的DNA量時(shí)結(jié)果還是陽性。對(duì)臨床上幾種流行豬病和兩種寄生蟲病的病料進(jìn)行檢測，結(jié)果都沒有擴(kuò)增出目標(biāo)片段，上述結(jié)果表明，該方法敏感性高、特異性強(qiáng)。在此基礎(chǔ)上對(duì)送檢的85份抗凝血樣進(jìn)行了檢測，其中檢出陽性34份，陽性率為40％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，弓形蟲PCR診斷方法是臨床檢測弓形蟲病的一種

4、行之有效的方法。 2.弓形蟲SAGⅠ基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建與表達(dá)產(chǎn)物抗原性的分析根據(jù)Genebank上公布的弓形蟲SAGⅠ的序列設(shè)計(jì)合成引物，PCR擴(kuò)增和克隆了SAGⅠ基因主要表面抗原部分編碼區(qū)段，并測定了核苷酸序列?？寺〉腟AGⅠ基因長度為978bp。進(jìn)一步將此片段亞克隆到原核表達(dá)載體pGEX-KG，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21菌株，Western-blot印跡檢測獲得了分子量為56KD的與谷胱苷肽-S轉(zhuǎn)移酶(GST)相融合的表達(dá)蛋白，具

5、有抗原性。這為下一步大規(guī)模獲取SAGⅠ進(jìn)行疫苗研究和診斷試劑的開發(fā)提供了條件。 3.弓形蟲主要表面抗原性基因SAGⅠ基因表達(dá)蛋白ELISA方法的建立和初步應(yīng)用利用在大腸桿菌中最佳的表達(dá)條件下體外表達(dá)了弓形蟲主要膜表面抗原SAGⅠ基因，提取、純化表達(dá)蛋白形成的包涵體，用提純的包涵體包被ELISA板來檢測抗弓形蟲抗體，建立了弓形蟲SAGⅠ蛋白的ELISA診斷方法。用該方法對(duì)豬的幾種其它傳染病做了檢測，檢測結(jié)果均為陰性；隨機(jī)抽取了5份