1、為建立弓形蟲(chóng)病標(biāo)準(zhǔn)、準(zhǔn)確、快速的免疫診斷體系及亞單位疫苗的研制，為弓形蟲(chóng)抗原的分離和純化及探索弓形蟲(chóng)的保護(hù)性免疫等研究提供適宜的工具，本研究利用經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心、微孔濾膜過(guò)濾、多次低速離心提純的弓形蟲(chóng)速殖子，再通過(guò)反復(fù)凍融和超聲波處理后作為抗原免疫 Balb/c小鼠6次，獲得針對(duì)弓形蟲(chóng)速殖子的抗體。間接 ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，6免后抗體效價(jià)均達(dá)到1：6400以上。
　　 本次建立的間接 ELISA方法，其主要條件如

2、下：0.5μg·mL-1的弓形蟲(chóng)速殖子為包被抗原，1％牛血清白蛋白為封閉劑，1：5000稀釋 HRP標(biāo)記羊抗鼠 IgG作為二抗，TMB(3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯)作為底物。實(shí)驗(yàn)證明，該方法特異性強(qiáng)，有較好的重復(fù)性。用該法對(duì)弓形蟲(chóng)速殖子免疫小鼠的血清抗體及其雜交瘤細(xì)胞單抗上清進(jìn)行檢測(cè)，獲得滿意的效果。
　　 以 PEG2000為促融劑，取效價(jià)高的免疫小鼠脾細(xì)胞與 NSO骨髓瘤細(xì)胞融合。經(jīng)間接ELISA方法篩選陽(yáng)性孔，有限稀釋法進(jìn)

3、行3～4次克隆和亞克隆，獲得4株能穩(wěn)定分泌抗弓形蟲(chóng)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株(3A3、3G3、4F4、4G3)，1株單抗腹水(3A3)。經(jīng)鑒定，4株雜交瘤細(xì)胞株的上清效價(jià)分別在1：800～12800之間，1株腹水(3A3)效價(jià)在1：51200，且穩(wěn)定性良好，單抗亞類為 IgG1，與豬等孢子球蟲(chóng)、豬隱孢子蟲(chóng)、豬旋毛蟲(chóng)、豬蛔蟲(chóng)等無(wú)特異性。采用免疫熒光法對(duì)腹水進(jìn)行初步鑒定，發(fā)現(xiàn)均為抗速殖子單抗。單抗的腹水提純后進(jìn)行 SDS-PAGE和 West

4、en-blotting分析，單抗的分子量均約為45kDa。用3A3A5單抗包板酶標(biāo)板與豬抗弓形蟲(chóng)抗體建立夾心 ELISA方法，單抗的最佳稀釋度為1：800，豬抗弓形蟲(chóng)高免血清的最佳稀釋度為1：1OO～200。特異性試驗(yàn)表明：該方法對(duì)于同屬于孢子蟲(chóng)屬的豬等孢子球蟲(chóng)、豬隱孢子蟲(chóng)、豬旋毛蟲(chóng)、豬蛔蟲(chóng)有較高的識(shí)別力，其 OD450nm值則顯著偏低。該方法不受其它外界因素的影響，靈敏度高，特異性強(qiáng)，對(duì)于臨床診斷和公共衛(wèi)生學(xué)將是一種簡(jiǎn)便、可靠的檢測(cè)方