1、雪花蓮凝集素(Galanthus nivalis agglminim，GNA)對咀嚼式害蟲和刺口式吸汁性害蟲具有毒殺性能而且對高等動物相對安全，作為Bt蛋白、胰蛋白酶抑制劑等殺蟲毒蛋白的功能互補和增強成分，成為植物基因工程中應用最廣泛的植物外源凝集素。目前，對轉基因GNA蛋白的檢測主要集中在基于DNA分子的遺傳學檢測。酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)技術能夠對直接關乎轉基因

2、食品安全的蛋白質進行檢測，而且ELISA技術具有快速、靈敏等優(yōu)點，適用于現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本篩查。兔單克隆抗體(monoclonal antibody，McAb)制備技術是目前相對較先進的生物技術之一。兔單克隆抗體技術應用于轉基因食品蛋白的檢測國內外未曾有相關報道。兔單克隆抗體相較于鼠單克隆抗體，具有能識別更多的新型表位、更高的親和性和更強的特異性等優(yōu)點。本研究擬通過獲得高質量雜交瘤細胞的基礎上，運用抗體重組技術獲得兔單克隆抗體，以使收集

3、得到的兔單克隆抗體的免疫捕獲能力進一步提高最終建立一種檢測GNA蛋白的基于兔單克隆抗體雙抗夾心ELISA檢測體系。其主要實驗內容和結果如下：
　　 (1)抗GNA兔多克隆抗體的制備及鑒定
　　 運用SDS-PAGE凝膠電泳對GNA免疫抗原蛋白的分子量和純度進行檢測。結果表明，GNA蛋白分子量約為14.3KDa，且純度較高，可作為獨立的抗原引起機體的免疫反應。用BCA蛋白檢測試劑盒測得GNA蛋白的濃度為1.64 mg/mL

4、。采用免疫技術，將GNA蛋白與等量弗氏完全佐劑乳化后注射入兩只兔子(B3365，B3366)體內。經(jīng)五次免疫之后選擇免疫效價較高的兔子(B3366)，取全血，經(jīng)Sepharose CL-4B Protein A柱分離純化兔多抗血清，并對其純度和效價分別進行凝膠電泳和間接ELISA檢測。結果表明，所獲得的抗GNA兔多克隆抗體純度較高，幾乎不含其它雜蛋白，效價在8000～32000之間。
　　 (2)抗GNA兔單克隆抗體的制備及鑒定

5、
　　 免疫兩只兔子(B3365，B3366)，選取效價較高的B3366號兔子的脾臟進入細胞融合階段。將兔子脾臟淋巴細胞與240E骨髓瘤細胞融合。運用間接ELISA法，經(jīng)過初篩復篩，獲得雙陽性克隆子6個(zju-17-2、Zju-17-3、zju-17-5、zju-17-6、zju-17-14、zju-17-17)，取其中三個(zju-17-3、zju-17-5、zju-17-6)進入抗體質粒重組階段，選取分泌單克隆抗體能力強且

6、抗體親和性高的配對(ziu-17-5(2L/2H))，進入單克隆抗體的大轉生產(chǎn)，最后將收集到的抗GNA兔單克隆抗體經(jīng)SepharoseCL-4B Protein A柱分離純化。
　　 經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分析，證實了該兔單克隆抗體的純度高，運用IgG檢測技術和間接ELISA檢測技術，分別獲得該目標抗體的初始濃度為2.28mg/mL，效價在32000～128000之間，親和常數(shù)為0.387×109L/mol。
　　

7、(3)檢測GNA夾心ELISA體系的建立和應用
　　 用生物素標記的兔多克隆抗體，其標記率為2.40、抗體濃度為7.67×10-6mol/L、生物素濃度為1.84×10-5mol/L。
　　 經(jīng)過嘗試，確立的雙抗夾心ELISA法是用4μg/mL抗GNA兔單克隆抗體作為一抗包被酶標板，二抗是稀釋20倍的生物素標記的兔多克隆抗體。酶標抗生物素稀釋400倍后加入，經(jīng)顯色9min，終止后測OD450。其中，GNA蛋白、生物素標記

8、兔多抗和酶標抗生物素的稀釋均用3％的脫脂牛奶。用該雙抗夾心ELISA法檢測GNA蛋白，檢測限(LOD)可達3.9～7.8 ng/mL，其線性檢測范圍為0.975～62.5 ng/mL。
　　 為了驗證該雙抗夾心ELISA檢測體系的實用性，將該方法應用于轉GNA基因稻米的檢測。通過對稻米進行預處理，再用雙抗夾心ELISA法對其進行檢測，并設置陰性對照和空白對照，同時制作標準曲線。試驗結果表明，轉GNA基因樣品的OD450(0.41