1、乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus, HBV)的感染嚴(yán)重影響著人類的健康,它能夠引起急、慢性病毒性肝炎。急性感染后,有5～10％的成年人發(fā)展為持續(xù)感染,最終可以導(dǎo)致慢性肝炎、肝硬化和肝癌。目前全球約有3.5億乙型肝炎病毒慢性感染者,迄今為止,還無有效的藥物能夠完全治愈乙肝患者。治療慢性乙型肝炎必須先了解其致病機制,以尋找合適的治療方法,但由于缺乏合適的HBV感染小動物模型,嚴(yán)重阻礙乙型肝炎病毒生物學(xué)和抗病毒治療方法的研究。

2、
　　針對上述問題確立本課題的研究目的:利用水動力轉(zhuǎn)染技術(shù)基于免疫正常的小鼠建立以螢火蟲熒光素酶(Firefly luciferase, Fluc)為報告基因標(biāo)記的HBV表達小鼠模型,以探討HBV的致病機制,并用此模型進行相關(guān)疫苗的評價,為開發(fā)治療性疫苗和抗病毒藥物奠定基礎(chǔ)。具體研究內(nèi)容如下:
　　1.Fluc標(biāo)記的HBV1.2倍基因組載體的構(gòu)建及體外表達
　　以pAAV/1.2HBV質(zhì)粒為模板,PCR擴增帶有反向重復(fù)

3、序列(ITR)的1.2倍HBV基因組片段,反向插入真核表達載體 pGL3-CP-Fluc中,構(gòu)建 Fluc標(biāo)記的HBV基因組表達質(zhì)粒pGL3-CP-Fluc-HBV1.2,并將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至Huh-7細胞中,檢測其在細胞的表達水平。結(jié)果表明,pGL3-CP-Fluc-HBV1.2在細胞中高水平表達Fluc,并可以正常分泌HBsAg,說明了我們所構(gòu)建的帶報告基因的HBV載體能夠在Huh-7細胞中表達。
　　2.報告基因標(biāo)記的HBV穩(wěn)定

4、表達小鼠模型的建立
　　通過水動力轉(zhuǎn)染將10μg質(zhì)粒pGL3-CP-Fluc-HBV1.2分別導(dǎo)入C57BL/6和BALB/c小鼠肝細胞內(nèi),觀察目的基因在小鼠體內(nèi)復(fù)制表達。
　　在BALB/c小鼠中,血清HBsAg表達水平在轉(zhuǎn)染后第1 w內(nèi)迅速升高,隨后快速下降,在轉(zhuǎn)染后第70 d HBsAg陽性率僅為為40％。而在C57BL/6小鼠中,HBsAg表達水平下降較緩慢,在轉(zhuǎn)染后第70 d HBsAg陽性率為80％,血清病毒滴度

5、在轉(zhuǎn)染后第1 d平均達到3.89×104copies/ml,在第4和7 d達到最高,分別為1.61×105和1.31×105copies/ml,隨后開始下降,在轉(zhuǎn)染的第70d仍維持在10 copies/ml以上。免疫組化檢測C57BL/6小鼠肝臟HBcAg的表達,結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)染后第3d HBcAg高水平表達,第135d HBcAg仍有表達,但表達水平降低。
　　活體熒光成像實時檢測小鼠肝臟Fluc,結(jié)果表明兩組小鼠均能持續(xù)高水平表

6、達Fluc,轉(zhuǎn)染后第7w Fluc的表達量仍然超過106 photons/sec。
　　因此,本研究建立的報告基因標(biāo)記的HBV小鼠模型能夠穩(wěn)定表達 HBV標(biāo)志物和Fluc,為進一步進行HBV的疫苗評價提供了基礎(chǔ)。
　　3.報告基因標(biāo)記的HBV穩(wěn)定表達小鼠模型在疫苗評價中的初步應(yīng)用
　　構(gòu)建編碼HBcAg的DNA疫苗pVAX1-HBc,以pVAX1空載體作對照,通過電穿孔法免疫C57BL/6小鼠后,水動力轉(zhuǎn)染pGL3-C

7、P-Fluc-HBV1.2質(zhì)粒,觀察小鼠體內(nèi)HBV標(biāo)志物和Fluc的表達,并結(jié)合血清ALT檢測和肝臟組織學(xué)分析,探討HBV特異性CTLs在病毒清除過程中的作用機制。pVAX1-HBc免疫的小鼠血清中均檢測到HBcAb。在pGL3-CP-Fluc-HBV1.2轉(zhuǎn)染后第21 d,pVAX1-HBc免疫組小鼠血清HBsAg、HBV DNA和肝臟Fluc表達水平與對照組相比顯著降低,至28 d三者表達完全消失;這可能是由于HBV特異性CTLs在

8、清除病毒的同時導(dǎo)致了肝細胞的破壞,從而引起肝臟Fluc表達的降低。血清ALT和肝臟HE染色結(jié)果也證實, pVAX1-HBc免疫組在轉(zhuǎn)染后第14和21 d血清ALT值顯著高于對照組,肝細胞的炎癥反應(yīng)范圍也比對照組更為廣泛。進一步證實了HBV特異性CTLs能夠通過細胞毒作用抑制病毒的復(fù)制。
　　用重組(酵母)乙肝表面抗原和生理鹽水皮下免疫C57BL/6小鼠后,水動力轉(zhuǎn)染pGL3-CP-Fluc-HBV1.2,觀察小鼠體內(nèi)HBV標(biāo)志物和

9、Fluc的表達。表面抗原免疫組小鼠血清中檢測到HBsAb,轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后的第1 d HBsAg就呈低水平的表達,隨后快速下降直至陰性;血清中HBV DNA在轉(zhuǎn)染第7 d開始明顯降低,至21 d降至陽性臨界值以下。而生理鹽水免疫組小鼠血清HBsAg和HBV DNA的表達均持續(xù)陽性?；铙w熒光成像檢測肝臟Fluc的活性表明Fluc表達在兩組中沒有明顯差異。說明了HBsAg蛋白疫苗免疫的小鼠主要通過體液免疫抑制體內(nèi)感染。
　　綜上所述,本研究