1、惡性腫瘤中，肺癌的發(fā)病率和致死率已經(jīng)越來(lái)越高。目前已有文獻(xiàn)報(bào)道，Wnt通路的失調(diào)與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。Disheveled蛋白(Dv1)是Wnt信號(hào)通路中位于上游的一個(gè)效應(yīng)分子，是經(jīng)典Wnt/β-catenin通路、非經(jīng)典Wnt(PCP)通路和Wnt/Ca2+通路的重要調(diào)節(jié)因子。
　　 dNKD(Naked Cuticle Drosophila)首次被發(fā)現(xiàn)是在果蠅體內(nèi)，其基因的突變能誘發(fā)果蠅分節(jié)運(yùn)動(dòng)的缺失。此后，NKD1和

2、NKD2作為哺乳動(dòng)物體內(nèi)Naked CuticleDrosophila的兩個(gè)同系物，也相繼被報(bào)道。NKD1和NKD2的基因分別位于人體染色體16q12.1和5p15.3。兩者在整個(gè)氨基酸序列上存有43.8％的高度同源。NKD1含有470個(gè)氨基酸序列，它在胞漿通過(guò)其EF-Hand區(qū)域與Dv1結(jié)合，從而抑制了經(jīng)典的Wnt通路。有文獻(xiàn)報(bào)道，NKD抑制了經(jīng)典的Wnt通路，卻激活了PCP通路，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮著重要的作用。有人在直腸腺癌和肝母細(xì)胞

3、瘤中發(fā)現(xiàn)，NKD1的mRNA水平要明顯高于正常組織。NKD1的基因是經(jīng)典Wnt通路的下游靶基因之一，受經(jīng)典通路的調(diào)控。在體內(nèi)可能存在一種負(fù)反饋的機(jī)制調(diào)節(jié)著NKD1的水平。然而具體的機(jī)制不是很清楚。
　　 盡管有關(guān)NKD1是如何發(fā)揮生物學(xué)功能已有一些報(bào)道，但NKD1與腫瘤的關(guān)系目前報(bào)道較少。NKD1在NSCLC中的的表達(dá)及其與臨床病理因素之間的關(guān)系尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了非小細(xì)胞肺癌中NKD1的表達(dá)情況及其臨床意義，并在肺癌細(xì)胞

4、系中干擾了NKD1的表達(dá)，觀察對(duì)肺癌細(xì)胞系侵襲能力的影響。
　　 材料與方法：
　　 一、患者信息和樣本
　　 100例非小細(xì)胞肺癌標(biāo)本來(lái)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一臨床醫(yī)院病理科存檔蠟塊。術(shù)前均未接受化療或放射治療?；颊叩钠骄挲g是58歲。根據(jù)WHO組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)，腺癌67例，鱗癌33例。根據(jù)2009年國(guó)際抗癌聯(lián)盟TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期24例，Ⅱ期20例，Ⅲ期44例，Ⅳ期12例。另外還有66例具有完整的隨訪資料。

5、>　　 另收集35對(duì)新鮮的肺癌組織及相對(duì)應(yīng)的周圍正常的肺組織，保存在-70℃箱內(nèi)，用于提取蛋白質(zhì)和RNA。
　　 二、免疫組織化學(xué)
　　 所有的組織塊經(jīng)中性甲醛固定，石蠟包埋，制成4微米厚度的切片。采用S-P免疫組化法進(jìn)行染色。一抗使用兔源性的NKD1(1:100，santa cruz biotechnology)抗體4℃孵育過(guò)夜。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。生物素標(biāo)記的二抗37℃孵育30分鐘，DAB顯色。
　

6、　 三、免疫組化結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)
　　 每張切片×400倍下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。根據(jù)著色細(xì)胞的百分比，NKD1的表達(dá)被劃分成五個(gè)等級(jí)：0分（無(wú)著色），1分(1-25％)，2分(26-50％)，3分(51-75％)，4分（76％以上）。再根據(jù)細(xì)胞著色的強(qiáng)度，NKD1的表達(dá)又被劃分成3個(gè)等級(jí)：0分（無(wú)著色），1分（淺黃色顆粒），2分（深黃色或者黃褐色顆粒）。每一張組織切片都對(duì)應(yīng)一個(gè)百分比分?jǐn)?shù)和著色分?jǐn)?shù)，將二者相

7、乘，所得的乘積即為該切片的最終得分。
　　 根據(jù)35例正常的支氣管上皮染色后，其得分均大于3分。據(jù)此，我們將大于或者等于3分的計(jì)為正常表達(dá)，而小于3分的計(jì)為低表達(dá)。
　　 四、RT-PCR和Real-TimePCR
　　 細(xì)胞或者剪碎的組織利用Trizol試劑(Invitrogen)裂解，然后按照說(shuō)明書(shū)的步驟，提取總的RNA。我們使用AMVVer3.0(Takara，Shiga, Japan)試劑盒。PCR產(chǎn)物通

8、過(guò)2％的瓊脂糖凝膠電泳，采用Bio-Imaging System進(jìn)行灰度值測(cè)定，以MMP7/β-Actin作為相對(duì)表達(dá)量。Real-Time PCR實(shí)驗(yàn)的引物有Takara生物制劑公司設(shè)計(jì)合成，使用SYBR Green試劑盒，以β-Actin作為內(nèi)參。并用Stratagene MxPro軟件分析RNA的相對(duì)表達(dá)量。
　　 五、免疫印跡分析
　　 組織或細(xì)胞采用RIPA裂解液進(jìn)行充分裂解，然后提取總蛋白，取100微克的總蛋

9、白通過(guò)10％濃度的SDS-PAGE凝膠進(jìn)行蛋白電泳，然后轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。1％脫脂奶粉封閉2小時(shí)，一抗NKDⅠ(1:200，Santa Cruz)，NKDⅡ(1:500，Cell Signaling)，β-Actin(1：500)4°過(guò)夜。山羊抗兔二抗37℃孵育2小時(shí)。ECL發(fā)光后，Bio-Image system進(jìn)行條帶灰度值測(cè)定，以NKD1/β-Actin的比值作為相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次進(jìn)行。
　　 六、細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染<

10、br>　　 HBE細(xì)胞系從中科院細(xì)胞庫(kù)獲得。LH7和BE1是來(lái)自zhengjie教授的友好惠贈(zèng)。肺鱗癌LK和腺癌LTEP購(gòu)自美國(guó)生物學(xué)公司。細(xì)胞系均用含有10％小牛血清和100U/mL青鏈霉素的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，并將其置于5％濃度的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　 細(xì)胞接種在24孔板內(nèi)，24小時(shí)候后以60ng/mL的NKD1 siRNA(SC-93414，購(gòu)買于santa cruz公司)，采用Lipo2000(Invitrog

11、en，Carlsbad，CA)脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后進(jìn)行檢測(cè)。
　　 七、細(xì)胞基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)
　　 以雙無(wú)的1640培養(yǎng)基按照1：3的比例稀釋基質(zhì)膠(BD Biosciences)，鋪在8微米孔徑的上室。以100微升含有5×105個(gè)的細(xì)胞密度接種在上室。下室放含有10％小牛血清的培養(yǎng)基。種植后培養(yǎng)48小時(shí)后，甲醇固定15分鐘，蘇木素染色。隨機(jī)選取10個(gè)視野，計(jì)數(shù)侵襲到小室下的細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，取均值

12、。
　　 八、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 所有的數(shù)據(jù)采用SPSS13.0版本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用Chis-Square檢驗(yàn)NKD1表達(dá)與臨床病理因素之間的關(guān)聯(lián)。采用t檢驗(yàn)檢測(cè)Westem Blot和RT-PCR結(jié)果中的灰度值。采用Kaplan-Meier法檢測(cè)NKD1對(duì)患者生存時(shí)間的影響。Cox回歸模型用以研究不同的變量對(duì)患者生存的影響。P＜0.05作為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、肺癌組織中NKD1蛋白

13、表達(dá)下調(diào)，而mRNA表達(dá)上調(diào)
　　 我們從35對(duì)肺癌及癌旁正常的肺組織中提取的總蛋白，Western Blot檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肺癌中NKD1的蛋白水平要明顯低于周圍肺組織(P=0.009)。
　　 接著我們?cè)谌N細(xì)胞系中進(jìn)一步進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果顯示，正常的支氣管上皮細(xì)胞系HBE的NKD1蛋白表達(dá)量明顯高于兩種肺癌細(xì)胞系BE1（侵襲力較高的）和LH7(侵襲能力相對(duì)低一些)，并且高侵襲力的BE1比LH7中的NKD1蛋白水平更低。

14、
　　 細(xì)胞系中的結(jié)果提示我們，NKD1蛋白的表達(dá)水平可能與肺癌細(xì)胞的侵襲能力有關(guān)。但Real-Time PCR的檢測(cè)結(jié)果卻表明，NKD1mRNA在肺癌中的表達(dá)量要明顯高于癌旁正常肺組織，并且我們?cè)谌N細(xì)胞系中也得到了同樣的結(jié)果。
　　 2、NKD1蛋白的表達(dá)下調(diào)與肺癌的臨床病理因素和不良預(yù)后相關(guān)
　　 我們將35例正常的支氣管上皮組織切片進(jìn)行染色，免疫組化評(píng)估結(jié)果顯示，其得分值均大于或者等于3分，將其作為正常表

15、達(dá)。然而，在100例非小細(xì)胞肺癌的組化結(jié)果中，有78例(78％)的表現(xiàn)為低表達(dá)，22例(22％)為正常表達(dá)。
　　 我們采用了SPSS軟件分析了低表達(dá)的NKD1和肺癌的臨床病理因素之間的聯(lián)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：低表達(dá)的NKD1與肺癌的組織類型(P=0.003)，低分化(P=0.004)，高TNM分期(P=0.002)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)(P=0.013)相關(guān)，采用Kaplan-Meier生存分析也發(fā)現(xiàn)NKD1低表達(dá)的肺癌患者其預(yù)后生存時(shí)間要明顯低

16、于正常表達(dá)的肺癌患者(P=0.03)。并且Cox風(fēng)險(xiǎn)模型分析結(jié)果表明，NKD1蛋白是影響肺癌患者預(yù)后的一個(gè)危險(xiǎn)因素之一(P=0.017)。
　　 3、NKD1的蛋白下調(diào)可以上調(diào)Dishevelled-1,β-Catenin的蛋白表達(dá)，并增強(qiáng)了MMP-7基因的轉(zhuǎn)錄和肺癌細(xì)胞系的侵襲能力
　　 采用siRNA技術(shù)下調(diào)NKD1的蛋白表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)肺癌細(xì)胞系中Dishevelled-1和β-Catenin的蛋白水平隨之上調(diào)。為了檢

17、測(cè)NKD1對(duì)肺癌細(xì)胞系侵襲能力的影響，下調(diào)NKD1的蛋白表達(dá)后，進(jìn)行基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：干擾NKD1后，肺癌細(xì)胞系LTEP和LK的侵襲能力均增強(qiáng)。然而干擾的同時(shí)孵育Dishevelled-1的特異性抗體后，細(xì)胞的侵襲能力發(fā)生了下調(diào)。
　　 緊接著，我們檢測(cè)了經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路下游靶基因MMP-7的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：下調(diào)NKD1的蛋白表達(dá)后，MMP-7基因的轉(zhuǎn)錄水平增加，并且這一上調(diào)受Dishevelled-1的影響。<