1、前言:
　　 甘草甜素(G1ycyrrhizin,GL)是甘草中三萜皂甙的主要成分,具有抗病毒、抗炎、抗過敏、抗變態(tài)反應、抗腫瘤等作用,國內外的研究已證明它對機體免疫系統(tǒng)功能產(chǎn)生一定的調節(jié)作用。甘草甜素具有廣泛藥理作用,其免疫調節(jié)作用表現(xiàn)在對免疫活性細胞、細胞因子、補體等的促進作用。故臨床上已廣泛應用于急性、慢性肝炎、濕疹、蕁麻疹及過敏性皮膚病、藥物疹和嗜酸性粒細胞增多癥以及AIDS等疾病的治療。
　　 自然殺傷細胞(n

2、aturalkiller,NK)來源于骨髓淋巴樣干細胞,主要分布于外周血和脾臟。NK細胞不表達特異性抗原識別受體,是不同于T,B淋巴細胞的第三類淋巴細胞。NK細胞無需特異性抗原識別便可以直接殺傷腫瘤細胞和病毒感染的細胞。NK細胞殺傷靶細胞主要是通過與靶細胞直接接觸,分泌殺傷介質穿孔素、顆粒酶、TNF和NK細胞毒因子(LT)等導致靶細胞死亡。另一方面,NK細胞還可通過分泌IFN-γ、INF-α、GM-CSF、LT、IL-8和IL-5等有免

3、疫調節(jié)作用的細胞因子途徑來間接殺傷靶細胞。
　　 目前,已有一些研究表明GL對機體免疫功能具有調節(jié)作用,但其作用機制尚不十分清楚。鑒于甘草甜素和NK細胞在免疫系統(tǒng)中的重要地位,本研究以NK-92MI細胞株為研究體系,首先研究了GL對NK-92MI細胞增殖活性和殺傷活性等功能的影響,并分析了殺傷介質(穿孔素和顆粒酶B)的釋放與GL增強NK92-MI細胞殺傷活性的關系;其次研究了IFN-γ的釋放及IFN-γ和IP-10的tuRNA的

4、表達,以揭示GL對NK細胞生物學活性調控作用的機制;最后研究了GL對NK92-MI細胞活化性受體NCRs表達的影響,以及活化性受體與抑制性受體的之間的平衡,進一步闡明GL對NK-92MI細胞功能的調控作用及內在作用機制。
　　 材料和方法:
　　 1.細胞培養(yǎng)
　　 NK細胞株:NK一92MI細胞株為非IL-2依賴性NK-92MI細胞株(NK-92MI細胞來自一個進行性非霍奇金淋巴瘤患者,1998年建系),購自中

5、科院上海細胞庫;用含12.5%胎牛血清和12.5%馬血清的α-MEM培養(yǎng)基(不含RNA和DNA)傳代培養(yǎng)。
　　 K562細胞株:K562細胞用含12.5%胎牛血清的1640培養(yǎng)基(不含RNA和DNA)傳代培養(yǎng)。
　　 2.CCK-8法測定GL對NK-92MI細胞增殖活性的影響。
　　 3.CCK-8法測定GL對NK-92MI細胞殺傷活性的影響。
　　 4.Western-Blot法測定GL對NK-92M

6、I細胞殺傷介質(穿孔素和顆粒酶B)蛋白表達的影響。
　　 5.ELISA法測定GL對NK-92MI細胞分泌IFN-Y量的影響。
　　 6.Real-TimePCR法測定GL對NK-92MI細胞IP-10和IFN-γmRNA表達的影響。
　　 7.Real-TimePCR法測定NCRs(NKp46、NKp44和NKp30)mRNA表達的影響。
　　 8.流式細胞術檢測傳遞抑制信號和活化信號的重要受體(NKG

7、2A/NKG2D)膜表達的影響。
　　 9.統(tǒng)計學分析
　　 所得實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(x±SD)表示,各組間均數(shù)比較采用一維方差分析(one-wayANOVA),p＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 實驗結果:
　　 一、GL對NK-92MI細胞增殖作用的影響
　　 一定濃度(25μg/ml～0.39μg/m1)的GL作用24h后,6.25μg/ml～0.39μg/ml的GL對NK-92M

8、I細胞的增殖有明顯促進作用,而25μg/ml的GL對NK92-MI細胞有明顯的抑制作用。
　　 二、GL對NK-92MI細胞殺傷活性的影響
　　 一定濃度(25μg/ml～0.39μg/ml)的GL作用24h后,各濃度GL對NK-92MI細胞的殺傷活性均顯示有明顯增強作用。
　　 三、GL對NK-92MI細胞穿孔素和顆粒酶B蛋白表達的影響
　　 選擇對殺傷活性增強作用較大的濃度(25μg/ml～0.39μ

9、g/ml)的GL作用NK-92MI細胞24h,0.39μg/ml～0.78μg/mlGL可明顯增加HNK-92MI細胞穿孔素和顆粒酶B的蛋白表達,6.25μg/ml～25μg/mlGL可明顯抑制NK-92MI細胞穿孔素的蛋白表達。
　　 四、GL對NK-92MI細胞IFN-γ釋放量的影響
　　 選擇對殺傷活性增強作用較大的濃度(25μg/ml～0.39μg/ml)的GL作用NK-92MI細胞72h,結果顯示在濃度為6.2

10、5μg/ml～0.39μg/ml的GL作用下NK細胞對IFN-γ的釋放明顯增加,而當濃度為25μg/ml的GL則可明顯抑制IFN-γ的釋放。
　　 五、GL對NK-92MI細胞IP-10和IFN-γmRNA表達的影響
　　 選擇對殺傷活性增強作用較大的濃度(1.56μg/ml～0.39μg/ml)的GL作用NK-92MI細胞12h,結果顯示在濃度為0.78μg/ml的GL作用下IP-10和IFN-γmRNA表達明顯增加。

11、
　　 六、GL對NK-92MI細胞活化性受體NCRs(NKp44、NKp46、NKp30)mRNA表達的影響。
　　 選擇對殺傷活性增強作用較大的濃度(6.25μg/ml～0.39μg/ml)的GL作用NK-92MI細胞24h,結果證實當濃度為0.39μg/mlGL可顯著增加NKp30,NKp44,NKp46mRNA的表達,濃度為0.78μg/ml～6.25μg/ml的GL顯著抑制NKp30和NKp44mRNA的表達。

12、
　　 七、GL對NK92-MI細胞NKG2MG2D膜表達的影響
　　 選擇對殺傷活性增強作用較大的濃度(1.56μg/ml～0.39μg/ml)的GL作用NK-92MI細胞24h,結果顯示在濃度為1.56μg/ml和0.78μg/ml的GL作用下NKG2A/NKG2D的膜表達明顯增加。
　　 結論:
　　 1.一定濃度范圍(6.25μg/ml～0.39μg/ml)的甘草甜素對NK-92MI細胞的增殖活性

13、有促進作用。
　　 2.一定濃度范圍(25μg/ml～0.39μg/ml)的甘草甜素對NK-92MI細胞殺傷活性有促進作用。
　　 3.濃度為0.39μg/ml～10.78μg/ml的GL可增加NK-92MI細胞殺傷介質(穿孔素和顆粒酶B)的蛋白表達,說明GL對NK-92MI細胞殺傷活性的增強作用,是通過增加其殺傷介質(穿孔素和顆粒酶B)的合成來實現(xiàn)的。
　　 4.濃度為6.25μg/ml～0.39μg/ml的G

14、L可誘導NK-92MI細胞中IFN-γ的釋放增加,濃度為0.78μg/ml的GL可以明顯上調NK-92MI細胞的IP-10和IFN-γmRNA的表達,說明GL是通過在局部上調IP-10mRNA的表達水平來激活具有IP-10受體的自然殺傷細胞,使自然殺傷細胞釋放大量IFN-γ,進而發(fā)揮NK細胞的殺傷作用。
　　 5.濃度為0.39μg/ml的GL可誘導NK-92MI細胞中NCRs(尤其是NKp46)mRNA的表達明顯增加。濃度為1