1、胚胎干細胞(Embryonic stem cells,ESCs)是一種從哺乳動物囊胚的內(nèi)細胞團(inner cellmass,ICM)或者原始生殖細胞(primordial germ cells,PGCs)中分離出來的一群具有全能性分化潛能的未分化細胞。自從小鼠胚胎干細胞系成功建立以來,胚胎干細胞憑借著其獨特的全能性以及無限增殖能力受到了眾多研究者的青睞。人們對它寄予厚望,越來越多的研究領(lǐng)域希望通過胚胎干細胞來攻克以前難以攻克的難題。<

2、br>　　 本實驗的目的是希望通過對昆明白小鼠囊胚的培養(yǎng),從其自然孵化的內(nèi)細胞團(ICM)中分離培養(yǎng)胚胎干細胞,摸索昆白品系胚胎干細胞的培養(yǎng)條件,建立昆明白小鼠胚胎干細胞系。并且利用建立的胚胎干細胞系作為介導,用胚胎干細胞法建立昆明種熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠模型。ES細胞的無血清無滋養(yǎng)層培養(yǎng)是一項難度較大的工作,且現(xiàn)有的ES細胞系大多是用國外品系的近交系小鼠建立的。昆明白小鼠作為我國應(yīng)用最多的遠交系實驗小鼠,其繁殖能力強及遺傳差異大的特點使

3、得其有著廣泛的應(yīng)用前景,并且其低廉的價格使得實驗的成本大大降低,更適合于節(jié)約實驗成本。建立昆明白小鼠ES細胞系以及該品系的轉(zhuǎn)基因小鼠有利于以其為實驗材料的各項實驗的順利高效進行,并且可以大大降低大規(guī)模實驗的成本。而無血清無滋養(yǎng)層培養(yǎng)更是可以避免動物源性,簡化實驗操作步驟,提高實驗的效率。
　　 本實驗經(jīng)過對昆明白小鼠囊胚ICM的培養(yǎng),成功的獲得并培養(yǎng)了三株昆明白小鼠胚胎干細胞,并且對其進行了多方面的鑒定,主要結(jié)論如下:
　

4、　 (1)用3i培養(yǎng)液成功培養(yǎng)囊胚,并由囊胚自然孵化獲得胚胎干細胞。
　　 (2)用2×3i培養(yǎng)液成功培養(yǎng)了獲得的昆明白小鼠胚胎干細胞,傳代數(shù)在40代以上。
　　 (3)對獲得的昆明白小鼠胚胎干細胞進行堿性磷酸酶染色,結(jié)果呈陽性。
　　 (4)對獲得的昆明白小鼠胚胎干細胞進行免疫熒光檢測,結(jié)果呈陽性。
　　 (5)對獲得的昆明白小鼠胚胎干細胞進行Western blot檢測Oct4及Sox2,結(jié)果均有表

5、達。
　　 (6)對獲得的昆明白小鼠胚胎干細胞進行Real-Time qRT-PCR檢測Oct4、Sox2、Klf4,結(jié)果表達量與mESC接近,與MEF有顯著差別。
　　 (7)對獲得的昆明白小鼠胚胎干細胞進行畸胎瘤成瘤實驗,6周左右成瘤,成瘤率在85％左右。
　　 (8)用pLV300-H794病毒感染獲得的昆明白小鼠胚胎干細胞,獲得帶有紅色熒光的昆明白小鼠胚胎干細胞。
　　 本實驗利用最新的3i培養(yǎng)系