1、胚胎干細(xì)胞具有自我更新及多向分化潛能，為胚胎發(fā)育學(xué)、遺傳學(xué)、人類疾病的發(fā)病機(jī)理與替代治療等研究提供非常寶貴的資源。由于不同來源的hES細(xì)胞株HLA等遺傳背景不一樣，其應(yīng)用價(jià)值也不同，因此需要建立更多的hES細(xì)胞株來滿足臨床與基礎(chǔ)等研究的需要。人類胚胎來源有限，獲得更多hES細(xì)胞系的根本途徑是改善培養(yǎng)體系，提高建系率。孤雌胚胎干細(xì)胞的研究可以避免倫理的限制，并且在細(xì)胞移植時(shí)不存在免疫排斥反應(yīng)，能夠保證治療的有效性，成為近期研究的熱點(diǎn)。本實(shí)

2、驗(yàn)首先探討影響hES細(xì)胞建系的因素，建立一套穩(wěn)定高效的hES分離培養(yǎng)體系，并建立廢棄胚胎來源的hES細(xì)胞系；進(jìn)一步激活小鼠卵母細(xì)胞，建立小鼠孤雌胚胎干細(xì)胞系，為人類孤雌胚胎干細(xì)胞及核移植胚胎干細(xì)胞建系研究奠定基礎(chǔ)。 第一部分人類胚胎干細(xì)胞建系方法的改良與廢棄胚胎來源的人胚胎干細(xì)胞系的建立與鑒定 第一章 hES細(xì)胞建系方法的改良及hES細(xì)胞系的建立 [研究目的]對(duì)hES細(xì)胞分離培養(yǎng)體系進(jìn)行改良，建立廢胚來源的hES

3、細(xì)胞系。 [材料方法] 1．收集IVF/ICSI治療周期第三天的低質(zhì)量胚胎，體外培養(yǎng)至：D5,D6天時(shí)，將早期囊胚轉(zhuǎn)入含有hLIF及bFGF細(xì)胞因子的G2.3培養(yǎng)液內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)1～2天，觀察囊胚ICM變化。 2．采用機(jī)械法與免疫外科法分離ICM，對(duì)比兩種方法獲得的原代克隆質(zhì)量及建系情況。 3．在hES培養(yǎng)液內(nèi)添加不同濃度的FBS及SR，比較其對(duì)hES建系的影響。 4．采用機(jī)械法、膠原酶Ⅳ消化及胰酶消

4、化進(jìn)行hES的傳代，比較三者對(duì)hES細(xì)胞擴(kuò)增效率的影響。 [結(jié)論] 1．在G2.3培養(yǎng)液內(nèi)添加hLIF以及bFGF進(jìn)行囊胚優(yōu)化培養(yǎng)，可改善囊胚質(zhì)量，使ICM明顯增殖。 2．在hES培養(yǎng)液內(nèi)同時(shí)添加SR以及少量的FBS，可以促進(jìn)ICM的增殖，減少其分化，提高h(yuǎn)ES細(xì)胞的建系率。 3．構(gòu)建了穩(wěn)定高效的hES細(xì)胞分離培養(yǎng)體系，為人類孤雌胚胎干細(xì)胞及核移植胚胎干細(xì)胞建系研究奠定基礎(chǔ)。 4．建立了4株廢胚來

5、源的hES細(xì)胞系，為發(fā)育生物學(xué)及遺傳學(xué)等研究提供新的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?第二章人類胚胎干細(xì)胞系的生物學(xué)特性鑒定 [研究目的]對(duì)所建立hES細(xì)胞系進(jìn)行干細(xì)胞生物學(xué)特性鑒定，了解其應(yīng)用價(jià)值。 [材料方法] 1．對(duì)hES細(xì)胞的生長(zhǎng)情況進(jìn)行觀察，計(jì)算其群體倍增時(shí)間。 2．所有的hES細(xì)胞體外培養(yǎng)至15代后，低密度傳代至四孔板，進(jìn)行AKP以及ES表面抗原SSEA-1，SSEA-4，TRA-1-60，TRA-1-81

6、染色鑒定。 3．Trizol法提取各株hES細(xì)胞的RNA，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)檢測(cè)Oct-4轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)情況。 4．hES細(xì)胞體外培養(yǎng)至10代后，開始進(jìn)行染色體核型鑒定，每隔10代檢測(cè)一次，每次計(jì)數(shù)20個(gè)分裂像。 5．體內(nèi)外分化能力檢測(cè)：懸浮培養(yǎng)hES細(xì)胞，觀察擬胚體的形成，并對(duì)自發(fā)分化的細(xì)胞進(jìn)行特異性抗原檢測(cè)；將hES細(xì)胞團(tuán)快接種到SCID小鼠的腹股溝皮下，觀察是否有腫瘤生長(zhǎng)。 6．提取各株hES細(xì)胞

7、的DNA，對(duì)其16個(gè)STR位點(diǎn)進(jìn)行鑒別。 [結(jié)論] 1．4株hES細(xì)胞系在體外長(zhǎng)期傳代中，能夠維持ES細(xì)胞的生物學(xué)特性，證明構(gòu)建的培養(yǎng)體系能夠維持hES細(xì)胞的自我更新能力。 2．STR位點(diǎn)分析用于hES細(xì)胞系的鑒定，可以為其提供相應(yīng)的“身份證”，區(qū)分不同的細(xì)胞株。 3．廢胚來源的hES細(xì)胞系，可能存在一些染色體遺傳方面的缺陷，必須進(jìn)行核型分析。 4．本實(shí)驗(yàn)建立了1株13三體平衡易位核型的hES細(xì)胞

8、系，該細(xì)胞系為遺傳病的發(fā)病機(jī)制研究提供豐富的細(xì)胞來源。 第三章三原核胚胎來源的 hES 細(xì)胞系的建立與鑒定 [研究目的]觀察三原核胚胎的發(fā)育潛能，建立三倍體hES細(xì)胞系，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定。 [方法] 1．收集IVF/ICSI治療周期中受精后第一天的三原核胚胎，在G1.3,G2.3培養(yǎng)液內(nèi)序慣培養(yǎng)，觀察三原核胚胎的發(fā)育潛能。 2．免疫外科法分離囊胚ICM,采用含有15％SR及5％FBS的培養(yǎng)

9、液進(jìn)行培養(yǎng)10天內(nèi)首次傳代，以后每4～5天傳代一次。 3．對(duì)獲得的ES細(xì)胞系進(jìn)行生物學(xué)特性鑒定，包括AKP染色，表面抗原染色，Oct-4轉(zhuǎn)錄因子檢測(cè)，核型鑒定，個(gè)體識(shí)別及分化能力檢測(cè)。 [結(jié)論] 1．三原核胚胎體外發(fā)育潛能差，大多停滯于6～8細(xì)胞期，只有極少數(shù)能夠發(fā)育到囊胚。 2．從三原核胚胎來源的囊胚可用于建立hES細(xì)胞系，建立的三倍體細(xì)胞系和正常二倍體細(xì)胞系一樣能夠自我更新及多向分化。 3．三

10、倍體hES細(xì)胞系的建立為探討多原核胚胎形成的原因，及多倍體胚胎的發(fā)育機(jī)制等研究提供新的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ? 第二部分小鼠孤雌胚胎干細(xì)胞系的建立與鑒定 [研究目的]探討小鼠卵母細(xì)胞孤雌激活的最適方法，建立小鼠孤雌ES的分離培養(yǎng)體系，并對(duì)其生物學(xué)特性及印記基因表達(dá)等進(jìn)行鑒定。 [方法] 1．采用SrCI<,2>聯(lián)合CB，以及Ionomycin聯(lián)合6-DMAP對(duì)(C57BL/6 x DBA/2)B6D2F1雜交小鼠的卵母

11、細(xì)胞進(jìn)行激活，胚胎在體外培養(yǎng)4天觀察其發(fā)育潛能，評(píng)估兩種方法的激活效果。 2．將獲得的囊胚與桑椹胚分別接種于飼養(yǎng)層細(xì)胞上，觀察孤雌胚胎原代ICM的生長(zhǎng)情況，比較建系率。 3．對(duì)建立的小鼠孤雌ES細(xì)胞系進(jìn)行AKP活性、表面標(biāo)志物、染色體核型及體內(nèi)外分化能力的鑒定。 4．微衛(wèi)星位點(diǎn)分析小鼠孤雌ES細(xì)胞系的基因型，并對(duì)其印記基因的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。 [結(jié)論] 1．采用SrCI<,2>聯(lián)合CB，Ionomyc

12、in聯(lián)合6-DMAP均能激活小鼠卵母細(xì)胞， SrCI<,2>聯(lián)合CB激活效果好。 2．本實(shí)驗(yàn)成功建立了12株小鼠的孤雌ES細(xì)胞系，和受精胚胎來源的mES細(xì)胞系一樣具有自我更新及分化全能性。 3．本研究首次由桑葚胚建立了小鼠孤雌ES細(xì)胞，該方法的成功為建立ES細(xì)胞系提供新的胚胎來源。 4．孤雌ES細(xì)胞的基因型為單倍體，在其傳代早期可以表達(dá)父本及母本來源的印記基因。 5．孤雌ES細(xì)胞系的建立為腫瘤學(xué)、表觀遺傳