1、研究背景和意義：外周神經損傷是臨床常見損傷，外周神經缺損的修復是世界性的難題，主要是神經生長速度慢和效應器、感受器萎縮快的矛盾。如何提高神經再生的速度和質量，尋找新的修復方法是外周神經損傷迫切需要解決的瓶頸問題。目前外周神經缺損的治療策略，是依據外周神經損傷再生的理論，通過提供一個神經纖維再生通道、營造有利于神經纖維再生微環(huán)境等，涉及神經導管及細胞因子的應用、細胞或神經移植、以及近年來興起的組織工程化外周神經等。這些治療方法已經在動物實

2、驗或臨床上取得了可喜的效果，但由于神經生長速度較慢，效應器的退化較為嚴重，用于修復長距離神經缺損效果不滿意。鑒于此，我們提出了“橋接神經元修復外周神經缺損”的設想，即通過神經元接力的方法，加快神經到達效應器、感受器的時間，減少效應器、感受器病變程度，提高神經損傷修復的效果。為驗證此設想，本研究從臨床實用出發(fā)，擬以骨髓源性神經組織定向干細胞(NTCSC)源性神經元細胞為種子細胞、以同種異體脫細胞神經支架為支架材料，構建神經元性組織工程化神

3、經，用于修復犬坐骨神經損傷，探討神經元性組織工程化神經修復外周神經的機制及效果，旨在為外周神經缺損的修復提供一個新的方法。
　　 第一部分NTCSC的培養(yǎng)、誘導分化及鑒定
　　 研究目的：研究骨髓源性神經組織定向干細胞(NTCSC)的分離、培養(yǎng)、鑒定及向神經元細胞的誘導分化，探討作為神經元細胞來源種子細胞的可能性。
　　 研究方法：取beagle犬自體骨髓，全骨髓培養(yǎng)，留取貼壁細胞，添加BFGF和EGF的無血清培

4、養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞聚集呈球狀時，吹打散開后傳代培養(yǎng)擴增，細胞鑒定。分別用RA+SHH和NRG1誘導分化，觀察誘導細胞形態(tài)、生長情況，檢測其表面標志。
　　 結果：傳代細胞懸浮、球形生長、增殖能力旺盛、Nestin陽性，為骨髓源性神經組織定向干細胞。RA+SHH誘導分化后，神經球貼壁、分散、β-Tubulin陽性、NeuN陽性，為神經元樣細胞。NRG1誘導后，神經球散開、長出較長的突起、表達S-100，為雪旺氏細胞。
　　

5、 結論：NTCSC擴增能力強、有神經系細胞的特性、易于向神經元樣細胞以及雪旺氏細胞分化，是較為理想的神經元細胞來源的種子細胞。
　　 第二部分神經元性組織工程化神經的的構建。
　　 研究目的：研究脫細胞支架制備、組織工程化神經的構建，制備神經元性組織工程化外周神經移植體。
　　 研究方法：取Beagle犬坐骨神經6cm，修剪、0.3％SDS脫細胞5天、RNA酶和DNA酶消化2天、蒸餾水反復漂洗5天、密封、60C

6、o輻照滅菌、4℃保存。將誘導的雪旺氏細胞和神經元樣細胞按照1∶1的比例混合成細胞懸液，用微量注射器種植到支架中，制成神經元性組織工程化神經移植體。
　　 結果：大體觀察見脫細胞神經支架外形完整，乳白色，H-E染色未見到細胞成分，纖維連續(xù)無斷裂。組織工程化神經移植體柔軟、飽滿，種植細胞在支架內生長，遷移、分布均勻。
　　 結論：成功構建了神經元性組織工程化外周神經移植體。
　　 第三部分神經元性組織工程化神經的體內

7、研究
　　 研究目的：研究神經元性組織工程化外周神經移植修復坐骨神經6cm缺損的效果，探討橋接神經元修復外周神經長段缺損的可行性。
　　 研究方法：制備犬雙坐骨神經6cm缺損模型6只，神經元性組織工程化神經、雪旺氏細胞性組織工程化神經和自體神經分別移植到相應的犬4側缺損的坐骨神經上。術后進行動物行為學觀察。術后13周，三組犬進行肌電圖檢測。4側神經元性組織工程化神經移植組行辣根過氧化物酶逆行追蹤；全部動物處死、取坐骨神經

8、、切片、免疫組織化學染色、甲苯胺藍染色、透射電鏡檢測；取腓腸肌、檢測蛋白質的含量。
　　 結果：術后犬下肢不能活動，自術后2周始，三組犬均出現(xiàn)下肢肌肉萎縮、足底潰瘍。術后8周，神經元性組織工程化外周神經移植犬對針刺有反應、下肢能觸地行走，自體神經移植組術后10周恢復感覺運動功能，雪旺氏細胞性組織工程化神經移植組術后13周恢復感覺運動功能。肌電圖檢測表明：神經元性組織工程神經恢復效果理想。
　　 神經元性組織工程化外周神經

9、移植犬腓腸肌中注射HRP后，神經移植體內可見天青色的團塊。免疫組織化學顯示，神經元性組織工程化神經移植體中NeuN陽性。甲苯胺藍染色，神經元性組織工程化神經移植體中髓鞘數(shù)量多于雪旺氏細胞性組織工程化神經移植組。透射電鏡顯示神經元性組織工程化神經移植體中有突觸的形成?？捡R斯亮藍檢測腓腸肌蛋白質含量，實驗組＞自體神經移植組＞雪旺氏細胞移植組。
　　 結論：種植的干細胞源性神經元樣細胞可以在外周神經微環(huán)境內存活、并維持神經元的功能，橋