1、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone Morphogenetic Proteins，BMPs)是轉(zhuǎn)化生長因子β(Transforming growth factorβ，TGFβ)超家族的成員之一，最初因為其能誘導骨和軟骨的形成而得名，目前認為，BMPs與系統(tǒng)發(fā)育中的細胞增殖和分化有關(guān)，BMPs可以調(diào)控間充質(zhì)干細胞向骨、軟骨、肌腱和脂肪分化。至今共分離和鑒定了20余種BMPs，主要已報道的具有誘導成骨活性的BMPs為BMP2、5、7等，其中BMP2和

2、BMP7已經(jīng)被用于臨床治療，但在臨床實際應用上效果還不能令人滿意。因此，尋找更強的誘導細胞成骨分化的細胞因子成為目前共同關(guān)注的課題，也是臨床的迫切需要。 在實驗室的前期研究工作中，我們通過重組腺病毒介導的方法，系統(tǒng)研究了BMP2～BMP15共14種BMPs在誘導骨形成中的的作用。采用間充質(zhì)干細胞C3H10細胞系，分別在體外和裸鼠體內(nèi)進行研究。發(fā)現(xiàn)除傳統(tǒng)BMP2、7外，BMP4、6、9也具有誘導成骨作用，其中BMP9誘導間充質(zhì)干細

3、胞C3H10成骨的作用，遠強于傳統(tǒng)應用的BMP2和BMP7。BMP9是目前已知的BMPs(包括BMP2、BMP7)中誘導成骨能力最強的因子，有希望作為一種更強的促進細胞成骨分化的細胞因子替代品，因此具有廣闊的潛在的臨床應用價值。 但是，BMP9誘導成骨的機制目前并不十分清楚。作為TGFβ家族成員，所有的BMPs(包括BMP9)都主要通過TGFβ信號轉(zhuǎn)導通路傳遞信號，發(fā)揮其誘導成骨的功能。首先BMPs與具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的

4、跨膜TGFβⅡ型和Ⅰ型受體結(jié)合，啟動信號轉(zhuǎn)導，隨后，磷酸化的Ⅰ型受體激活轉(zhuǎn)錄因子Smads，由激活的Smads調(diào)控細胞核內(nèi)相關(guān)基因的表達。因此，在BMPs信號轉(zhuǎn)導過程中，TGFβ受體起著承上(與BMPs結(jié)合)和啟下(活化Smads)的作用，是BMPs信號轉(zhuǎn)導的關(guān)鍵節(jié)點，是BMPs早期信號轉(zhuǎn)導的最重要的分子之一，與BMPs發(fā)揮誘導成骨的活性關(guān)系密切。BMP2和BMP7等成骨性BMPs，其相關(guān)的TGFβ受體已經(jīng)被鑒定和分析清楚，但是與BMP

5、9誘導成骨有關(guān)的TGFβ受體，目前了解很少，這也限制了對于BMP9誘導成骨機制的揭示?；谝陨戏治觯狙芯烤C合應用分子生物學、細胞生物學、實驗動物學等多項技術(shù)，如細胞培養(yǎng)、基因克隆、基因轉(zhuǎn)染、重組腺病毒、細胞分化實驗技術(shù)、real time PCR、動物模型、Micro-CT、組織化學染色等，主要鑒定分析與BMP9誘導成骨有關(guān)的TGFβ受體，為BMP9誘導成骨的機制，在受體水平上提供證據(jù)。整個研究分為兩大部分，主要研究結(jié)果如下：

6、 第一部分研究中，我們分析已知的七種TGFβⅠ型受體和四種TGFβⅡ型受體的核苷酸序列，PCR擴增含受體胞外結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域部分的片段，并將片段克隆入腺病毒穿梭質(zhì)粒載體pAdtrace-TO4，通過菌落PCR、限制性內(nèi)切酶酶切和DNA序列測定對陽性克隆進行鑒定，得到共11種TGFβ受體相應的顯性負性突變體(dn-receptor)質(zhì)粒；隨后，在BJAdeasy細菌中同源重組dn-receptor腺病毒質(zhì)粒，重組dn-receptor腺

7、病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細胞，使腺病毒在其中包裝和擴增，最后得到11種dn-receptor重組腺病毒。將制備的dn-receptor腺病毒感染目標細胞C3H10，在感染24小時后，熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)11種dn-receptor腺病毒均可在C3H10內(nèi)表達RFP紅色熒光蛋白，產(chǎn)生紅色熒光；在病毒感染C3H10細胞48小時后，提取細胞RNA，經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA，PCR擴增，結(jié)果顯示，所有11種dn-receptor均可在C3H10細胞內(nèi)表達

8、。通過這部分實驗，我們最終獲得了11種TGFβ受體相應的顯性負性突變體腺病毒，并驗證了其在細胞內(nèi)的表達。顯性負性突變的TGFβ受體可以與細胞內(nèi)的野生型受體競爭相應配體，抑制配體功能的發(fā)揮。該部分制備的腺病毒用于第二部分實驗，而且也可以用于TGFβ信號通路中與TGFβ受體有關(guān)的相關(guān)研究。 第二部分研究中，首先在體外實驗中，我們利用顯性負性突變型TGFβ受體腺病毒和BMP9共同作用間充質(zhì)干細胞C3H10、骨髓基質(zhì)細胞、小鼠胚胎成纖維

9、細胞(mouse embryonic fibroblasts，MEFs)和鼠成肌細胞C2C12，通過ALP定性和定量試驗以及熒光素酶報告基因試驗，初步篩選出了5種dn-receptor可以抑制BMP9誘導的ALP和熒光素酶活性，它們分別是dnALK1、dnALK2、dn-BMPRⅡ、dn-ActRⅡ和dnActRⅡB；進一步研究發(fā)現(xiàn)，它們對于ALP表達的抑制存在劑量依賴性，而且還可以抑制C3H10和MEFs細胞的鈣鹽沉積，抑制細胞的成骨

10、分化；通過Real-time PCR發(fā)現(xiàn)dnALK1、dnALK2、dn-BMPRⅡ、dn-ActRⅡ和dnActRⅡB這5dn-receptor可以抑制BMP9靶基因(Smad6，Smad7和Id1)的表達。將dnALK1、dnALK2、dn-BMPRⅡ、dn-ActRⅡ和dnActRⅡB和BMP9共感染C3H10細胞，在裸鼠皮下進行注射，5周后觀察并剝離皮下包塊，Micro-CT掃描和影像重建；石蠟包埋、切片，組織化學染色觀察包塊內(nèi)

11、細胞成骨情況，結(jié)果顯示與對照相比，dnALK1、dnALK2、dn-BMPRⅡ、dn-ActRⅡ和dnActRⅡB處理組成骨包塊偏小，而且其包塊內(nèi)成骨不活躍，表明dnALK1、dnALK2、dn-BMPRⅡ、dn-ActRⅡ和dnActRⅡB可以抑制BMP9誘導的C3H10在裸鼠皮下的成骨。從以上結(jié)果看這五種dn-recepotr相應的野生型受體(ALK1、ALK2、BMPRⅡ、ActRⅡ和ActRⅡB)很可能與BMP9誘導成骨有關(guān)。因

12、此，我們利用pSOS系統(tǒng)篩選了能抑制相應受體表達的siRNA(首先測試了ALK1和ALK2)，再利用RNAi抑制ALK1和ALK2的表達，發(fā)現(xiàn)抑制ALK1和ALK2表達后，BMP9誘導的熒光素酶活性可相應被抑制。綜上所述，本研究從細胞水平到動物整體水平，全面鑒定分析了可能與BMP9誘導成骨有關(guān)的TGFβ受體，從整個研究中我們得到以下研究結(jié)論： 1.TGFβ受體與BMP9誘導成骨活性密切相關(guān)，相應dn-receptor可以抑制BM

13、P9誘導的細胞成骨分化。 2.構(gòu)建和制備的dn-receptor腺病毒可以有效地在目標細胞中表達相應的dn-recepotr，因此，它們不但可以用于BMP9相關(guān)TGFβ受體的研究和分析，也可以用于TGFβ家族其它分子的研究(如BMP13，BMP14，它們對于軟骨形成有重要作用，其相關(guān)的TGFβ受體未知)。 3.通過測試C3H10、BMSC、MEFs和C2C12四種細胞發(fā)現(xiàn)：在7種Ⅰ型dn-receptor中，dnALK1

14、和dnALK2能有效抑制BMP9誘導的熒光素酶活性和早期成骨指標ALP活性；在4種Ⅱ型dn-receptor中，dn-BMPRⅡ、dn-ActRⅡ、dnActRⅡB可以有效抑制BMP9誘導的熒光素酶活性和ALP活性，而且這種抑制作用具有劑量依賴性。 4.進一步研究證實，dnALK1、dnALK2、dn-BMPRⅡ、dn-ActRⅡ、dnActRⅡB可以有效抑制BMP9誘導的鈣鹽沉積，并且可抑制BMP9調(diào)控的相關(guān)靶基因基因(Sma

15、d6，Smad7，Id1)的表達。因此，在11種TGFβ受體中，ALK1、ALK2、BMPRⅡ、ActRⅡ、ActRⅡB可能與BMP9誘導成骨有關(guān)。 5.通過pSOS系統(tǒng)篩選了能有效抑制ALK1、ALK2表達的小分子干擾RNA(siRNA)，發(fā)現(xiàn)在利用RNA干擾(RNAi)技術(shù)抑制C3H10細胞種ALK1、ALK2表達后，繼而可抑制BMP9誘導的熒光素酶活性，初步顯示在抑制目標細胞相關(guān)TGFβ受體表達后，BMP9成骨活性受到了抑