1、登革熱是一種由登革病毒(DengueVirus，DENV)引起的蟲媒傳染病，通過蚊子（以埃及伊蚊和白紋伊蚊為主）的叮咬在人群中傳播。人類感染DENV后將產(chǎn)生從輕到重的很大范圍的臨床癥候群。盡管絕大多登革熱患者顯示為一種類似流感樣的自限性疾病，如登革熱(DengueFever，DF)，然而患者的病情有可能發(fā)展到重癥登革熱，如登革出血熱(DengueHemorrhageFever,DHF)或登革休克綜合征(DengueShockSyndro

2、me，DSS)。在未能得到及時、有效治療的情況下，重癥登革熱將對患者的生命造成巨大的威脅。
　　 目前，登革熱被認為是世界上最為關(guān)注的公共衛(wèi)生問題，其原因主要在于該病的發(fā)病率高，流行范圍廣，并且缺乏行之有效的防治方法。近50年來，盡管全世界在登革熱的防治方面做了很多的努力，但是登革熱的發(fā)病率還是呈現(xiàn)出急劇上升的趨勢，給流行國家的衛(wèi)生防控體系以及患者的家庭帶來了沉重的經(jīng)濟負擔。
　　 DENV屬于黃病毒科，黃病毒屬，是一種

3、有包膜的單股正鏈的RNA病毒，基因組大約11kb長，包含一個開放性的閱讀框，編碼3個結(jié)構(gòu)蛋白和7個非結(jié)構(gòu)蛋白。三種結(jié)構(gòu)蛋白分別是衣殼蛋白(capsidprotein，C)，膜蛋白(membraneprotein，M)和包膜蛋白(envelopeprotein，E)。7種非結(jié)構(gòu)蛋白依次為NS1-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5。根據(jù)不同的E蛋白基因序列，DENV可被劃分為四種血清型，DENV-1～4。各種DENV的血

4、清型之間存在60-70％的同源序列。DENV的初次感染可以產(chǎn)生針對感染血清型的終生免疫保護反應(yīng)，但對其它三型DENV僅有短暫而微弱的交叉免疫保護作用。當二次感染的血清型不同于初次感染的血清型時，患者體內(nèi)存在的非中和交叉反應(yīng)性抗體或亞中和濃度的中和抗體可促進DENV進入Fc受體容受細胞，增加病毒的復(fù)制，容易導(dǎo)致嚴重的DHF/DSS的發(fā)生。
　　 迄今為止，登革熱的防治仍缺乏有效的疫苗和抗病毒治療方法，由此登革熱的防治在很大程度上依

5、賴于對登革熱進行早期、快速、精確的診斷。目前登革熱的診斷有三個金標準，登革熱病毒的分離與鑒定、RT-PCR以及血清學(xué)診斷。盡管這三種方法在登革熱的診斷中發(fā)揮著不可替代的作用，但是每種方法都存在自身的缺陷，例如登革熱病毒分離和鑒定需要的時間長，假陰性率高，對實驗室和實驗技術(shù)人員的要求高;RT-PCR不僅對實驗室環(huán)境、實驗設(shè)備和實驗人員的要求高，而且設(shè)備昂貴，難以推廣;另外，登革熱感染后，患者往往需要一定的時間才能出現(xiàn)抗體反應(yīng)，而且登革熱與

6、黃病毒的抗體之間存在廣泛的交叉，因此血清學(xué)方法雖然簡便、經(jīng)濟，但是不能進行早期診斷，而且可能因為存在黃病毒之間的交叉反應(yīng)而出現(xiàn)假陽性的結(jié)果。由此，建立一種簡單、方便、早期、快速、精確、經(jīng)濟的診斷方法仍是登革熱研究中亟待解決的問題。
　　 NS1蛋白是DENV中一種保守的糖蛋白，在感染的早期即可在血清中檢測到高濃度的存在，并與登革熱疾病的嚴重程度密切相關(guān)。近10余年來，各種形式的以NS1抗原捕獲為基礎(chǔ)的免疫分析法得以建立并商品化。

7、這些NS1抗原檢測方法都具有早期、快速、特異、價廉、易于操作等特點。通過對NS1抗體的精心選擇而建立的血清學(xué)特異性的NS1抗原抗捕獲ELISA甚至具有血清分型的作用，因此，以NS1抗原為靶標的免疫分析法在登革熱的診斷中具有重要作用。然而，NS1蛋白在登革熱感染的不同時期血清中的分布情況仍不甚明了。對于NS1蛋白動力學(xué)的充分揭示有助于分析NS1抗原檢測在登革熱診斷中的意義和作用。
　　 在本實驗室的前期工作中，我們用雜交瘤技術(shù)制備

8、了一組抗DENVNS1單抗，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)、免疫熒光試驗(immunofluorescenceassay，IFA)和蛋白印跡實驗(westernblot，WB)對這些單抗的免疫反應(yīng)性進行了分析，在此基礎(chǔ)上，通過對這些單抗的優(yōu)化配對，建立了高度敏感和特異的四種血清型特異性的NS1抗原捕獲ELISA，以及一種DENV群特異性的NS1抗原捕獲ELISA。在本研究中

9、，利用DENV-1特異性的NS1抗原捕獲ELISA，我們動態(tài)分析了NS1抗原在DENV-1初次感染患者不同發(fā)病時期血清中的分布情況，結(jié)合DENVIgM和IgG抗體的檢測，揭示了抗原抗體的聯(lián)合檢測在登革熱診斷中的作用。
　　 DENVNS1抗原的檢測不僅在登革熱的診斷中具有很大的優(yōu)勢，而且，基于NS1抗原檢測ELISA還具有DENV病毒滴定的作用。此外，利用NS1抗原檢測ELISA，在本研究中，我們還建立了一種DENV抗體檢測的微

10、中和試驗。結(jié)合商品化的DENVIgM和IgG抗體捕獲ELISA，本實驗室自制的DENVE蛋白Ⅲ區(qū)(EDⅢ)IgG抗體捕獲ELISA，我們對來自同一組DENV-1初次感染患者在發(fā)病期和3年后的隨診期血清中的中和抗體、DENVIgM和IgG抗體，EDⅢIgG抗體進行了檢測和比較，揭示了隨時間的變化DENV患者體內(nèi)抗體水平的動態(tài)變化情況，并為登革熱的流行病學(xué)調(diào)查以及登革熱疫苗有效性的驗證提供了可能更為有效的檢測手段。
　　 盡管NS1

11、抗原檢測的ELISA方法在登革熱的診斷中具有很好的敏感性，但這種方法的操作還是略嫌復(fù)雜。登革熱快速診斷用的膠體金法仍是許多臨床醫(yī)生和研究者的目標，但現(xiàn)有的NS1捕獲的膠體金法仍缺乏足夠的敏感性。在前期工作中，我們發(fā)現(xiàn)NS1抗原捕獲ELISA的檢測極限可達1:5120的血清稀釋度，提示這種方法中采用的單抗具有很高的親和力，但這些ELISA方法中使用的高親和力NS1單抗并不適合膠體金法。為開發(fā)高度敏感的登革熱快速診斷的膠體金法，需要對NS1

12、單抗親和力進行詳細的分析。在本研究中，我們采用了非標記技術(shù)，共振波導(dǎo)光柵(ResonantWaveguideGrating，RWG)和表面等離激元(SurfacePlasmonResonance，SPR)，對大量NS1單抗的親和力進行了篩選，從而為NS1檢測的膠體金法提供了詳細的抗原抗體相互作用的動力學(xué)信息。
　　 由此，本研究分為以下三個方面的內(nèi)容:
　　 第一部分:DENV-1初次感染患者血中NS1抗原和IgM和Ig

13、G抗體動態(tài)分布分析
　　 登革熱NS1抗原檢測和血清學(xué)分析是登革熱診斷中最為經(jīng)濟、有效的方法，在登革熱的診斷中具有非常重要的地位。在本研究中，我們用自制的DENV-1特異性的NS1抗原捕獲ELISA，結(jié)合商品化的IgM和IgG抗體捕獲ELISA，對廣州2006年DENV-1初次感染的確診患者在發(fā)病當天到發(fā)病27天的血清標本中的NS1抗原和IgM、IgG抗體在動態(tài)分布規(guī)律進行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在發(fā)病的當天，87.5％的患者血中即可

14、檢出陽性的NS1蛋白，在發(fā)病的第1到第7天，也就是整個登革熱病程的急性期，NS1的陽性檢測率在81.8％～91.1％之間的高水平檢測率范圍內(nèi)波動。而到了發(fā)病的第8到14天，也就是疾病的恢復(fù)早期，這種NS1檢測的敏感性呈現(xiàn)出明顯的下降，到發(fā)病的第14天后，也就是疾病的恢復(fù)晚期，NS1無法測到。與NS1抗原分布不同，IgM和IgG抗體分別在發(fā)病的第3和第5天才開始在血中顯現(xiàn)，并出現(xiàn)檢出率的逐漸升高。其中IgM抗體較IgG抗體不僅出現(xiàn)更早，而

15、且上升的速度更快，在發(fā)病的第8天，IgM的檢測達到檢測高峰的100％，而IgG抗體則在發(fā)病的第15天才達到檢測的高峰(100％)。NS1抗原和IgM抗體在血中的分布呈現(xiàn)一種相反的互補規(guī)律，當用兩者方法進行聯(lián)合檢測時，可大大提高登革熱診斷的敏感性、縮短檢測的窗口期、延長檢測的時限。表現(xiàn)為在兩者的檢出開始出現(xiàn)交叉的第3天一直到恢復(fù)期，聯(lián)合診斷的陽性率可高達96.6-100％，明顯高于單獨的NS1抗原或IgM抗體檢測的敏感性。研究表明，登革熱

16、NS1抗原和IgM、IgG抗體的聯(lián)合檢測為不同感染時期的初次感染患者提供了一個較為理想的登革熱診斷方案，這種方案基本上可以滿足對登革熱進行簡單、經(jīng)濟、快速、有效的診斷要求。
　　 第二部分:1型登革病毒初次感染患者急性期和康復(fù)期血清學(xué)動態(tài)分析
　　 登革熱患者血清中抗體的檢測不僅對登革熱的診斷，而且在登革熱流行病學(xué)調(diào)查以及疫苗有效性的驗證等方面具有重要作用，但登革熱感染后，各種抗體隨時間的動態(tài)變化情況尚未得到充分闡明，而

17、且現(xiàn)有的登革熱抗體檢測方法仍無法充分滿足臨床和研究的需要。在本研究中，利用DENVNS1抗原捕獲ELISA，我們建立了一種DENV中和抗體檢測的微中和試驗，結(jié)合商品化的PanbioIgM和IgG抗體捕獲ELISA，以及自制的抗登革熱EDⅢIgG抗體捕獲ELISA對DENV-1初次感染患者在發(fā)病期以及3年余后隨診期的血清標本進行了DENV相關(guān)抗體的檢測。研究發(fā)現(xiàn)，登革熱特異性的IgM和IgG抗體的檢出率隨時間的推移而發(fā)生下降，但抗EDⅢI

18、gG抗體的檢出率隨時間的推移在體內(nèi)繼續(xù)保持著穩(wěn)定的檢出率。在隨診期，抗EDⅢIgG抗體捕獲ELISA對血清標本檢測的敏感性顯著高于PanbioIgG抗體捕獲ELISA。這一結(jié)果不僅提示了EDⅢIgGELISA是一種更為敏感的抗體檢測方法，而且EDⅢIgG抗體在體內(nèi)的穩(wěn)定檢出率還提示了EDⅢ蛋白在登革熱的免疫發(fā)病機制中可能存在重要作用。而微中和實驗顯示，發(fā)病期血清的中和抗體在四型DENV中具有很強的交叉中和活性，但隨時間的推移，異型中和抗

19、體滴度出現(xiàn)下降，或者是持續(xù)維持著一個低水平，而同型中和抗體則隨時間推移出現(xiàn)滴度的上升，到隨診期，血清中同型中和抗體成為了最具優(yōu)勢的中和抗體。但本研究未能顯示EDⅢIgG抗體與中和抗體之間存在統(tǒng)計學(xué)上的相關(guān)性。本研究不僅揭示了登革熱感染后，各種抗體隨時間的變化而發(fā)生動態(tài)變化的規(guī)律，而且表明，本研究室自制的抗登革熱EDⅢIgG抗體捕獲ELISA，以及基于NS1抗原ELISA的微中和實驗可能是登革熱診斷和流行病學(xué)調(diào)查的有效的檢測工具，盡管其有

20、效性仍需要通過對更大樣本的進一步檢測而得證實。
　　 第三部分:共振波導(dǎo)光柵和表面等離激元技術(shù)對登革熱NS1單抗與NS1蛋白親和力的鑒定與比較
　　 盡管我們建立的DENVNS1ELISA具有較好的敏感性和特異性，但是這些NS1ELISA中所采用的抗體并不適用于膠體金法。基于DENVNS1抗原檢測的膠體金法是一種DENV的快速診斷方法，可以作為床邊診斷(bedsidediagnosis)以及現(xiàn)場、出入境的快速篩查，是DE

21、NV診斷的研究熱點。為尋找膠體金法NS1抗原檢測法適合的單抗，在本研究中，我們采用兩種免標記(non-labeled)技術(shù)，共振波導(dǎo)光柵(ResonantWaveguideGrating，RWG)和表面等離激元(SurfacePlasmonResonance，SPR)對DENVNS1單抗與NS1蛋白的親和性進行了進一步的分析。在前期利用免疫標記技術(shù)獲得的DENVNS1mAbs的免疫反應(yīng)性的基礎(chǔ)上，我們選出了80株，55株，75株和64株

22、分別針對DENV-1，DENV-2，DENV-3和DENV-4NS1的反應(yīng)性單抗。先用RWG這種高通量的免標記技術(shù)對這些單抗在飽和結(jié)合狀態(tài)下的親和力進行了初篩。結(jié)果顯示，這些抗體的親和力的范圍在10nM-1mM之間。隨后用SPR對這些抗體與抗原相互作用的動態(tài)過程進行了進一步的詳細分析。SPR方法的檢測不僅可以提供NS1單抗與NS1蛋白的親和力，也就是平衡解離常數(shù)(equilibriumdissociationconstant，KD)，而

23、且可以進一步提供兩者之間的結(jié)合常數(shù)(associationconstant，Ka)及解離常數(shù)(dissociationconstant，Kd)，以及代表NS1單抗對NS1蛋白可及性（accessibility）的單抗活性百分數(shù)。在本研究中，用SPR得出NS1單抗的親和力范圍位于1nM～100nM之間，這些單抗同時也是RWG方法檢測到的高、中親和力的單抗(KD=10nM～100nM)，但絕大部分抗體在SPR中顯現(xiàn)為無反應(yīng)性。SPR檢測出的

24、NS1單抗的Ka和Kd則分別波動在103到105Ms-1之間和10-7到10-2S-1之間。而DENV-1，DENV-2，DENV-3和DENV-4NS1反應(yīng)性的單抗的活性百分數(shù)則分別波動在1.6％-47.2％，2.5％-70.3％，1.0％-26.2％和0.9％-27.2％之間。除DENV-4NS1反應(yīng)性單抗外，在RWG所測得的高親和力(KD=10nM)單抗，其在SPR中測得的活性百分數(shù)顯著高于RWG測得為中等親和力（KD=100nM

25、）的單抗。研究表明，免標記的RWG和SPR技術(shù)是檢測分子之間相互作用的親和力的有效工具。當對大量標本進行篩查時，可先用高通量的RWG可以對大量的抗體初篩，排除低親和力和低活性百分數(shù)的標本，然后用SPR對高親和力和高活性百分數(shù)的抗體進行進一步動力學(xué)分析。根據(jù)SPR的檢測結(jié)果，一些具有高結(jié)合常數(shù)的NS1單抗可作為膠體金的NS1抗原檢測方法中的檢測和捕獲抗體，盡管其有效性仍需要得到進一步的驗證。
　　 小結(jié):
　　 通過以上三

26、部分的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本研究的具有以下三個創(chuàng)新之處，其中包括:
　　 一、利用我們建立的DENV-1特異性NS1抗原捕獲ELISA和商品化的PanbioIgM和IgG抗體捕獲ELISA，觀察了DENV-1初次感染確診患者從發(fā)病的第1天到第27天血清中NS1抗原和IgM、IgG抗體水平的動態(tài)變化情況。首次揭示了登革初次感染患者DENVNS1抗原和IgM抗體互補的消長規(guī)律，提示了NS1抗原檢測在急性期以及IgM抗體檢測在恢復(fù)早期登革熱

27、診斷中的作用，而這兩種方法的聯(lián)合檢測，不僅可以大大提高登革熱診斷的敏感性，而且可以縮短登革熱診斷的“窗口期”，延長登革熱診斷的時限。
　　 二、在本研究中，通過對同一組患者在發(fā)病期和隨診期血清中各種抗體動態(tài)分析發(fā)現(xiàn)，登革熱特異性的IgM和IgG抗體的檢出率隨時間的推移發(fā)生衰退，而抗EDⅢIgG抗體隨時間的推移依然保持著穩(wěn)定的檢出率，提示自制的DENVEDⅢIgG抗體捕獲ELISA有可能是一種有效的登革熱血清流行病學(xué)調(diào)查的工具。而

28、基于NS1抗原檢測的微中和實驗對系列血清中的中和抗體檢測提示，發(fā)病期血清的中和抗體在四型DENV中具有更強的交叉中和活性，但異型中和抗體滴度隨時間的推移出現(xiàn)下降，或者是一直維持著一個低水平，而同型中和抗體隨時間推移則出現(xiàn)上升，并逐漸顯示為優(yōu)勢的抗體中和效價。本研究不僅揭示了登革熱感染后，各種抗體隨時間的變化而發(fā)生動態(tài)變化情況，而且為登革熱的診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供了可能較為有效的登革熱感染的血清學(xué)檢測方法。
　　 三、為建立登革熱

29、進行快速診斷的NS1抗原捕獲膠體金法，我們采用了兩種檢測分子之間相互作用的免標記技術(shù)，RWG和SPR對DENVNS1單抗與NS1蛋白的親和力進行的鑒定與比較。其中，RWG是一種高通量的免標記技術(shù)，而SPR可對分子之間相互作用的動力學(xué)信息進行詳細地分析。研究發(fā)現(xiàn)，RWG對抗原抗體結(jié)合的飽和狀態(tài)下的親和力的篩查，不僅可以檢測出在SPR中高親和力的抗體，而且還能檢測出高活性百分數(shù)的抗體。而SPR的進一步分析提供了抗體的結(jié)合常數(shù)和解離常數(shù)，其中