1、目的：盡管VEGF的發(fā)現(xiàn)距今已有很多年，但人們對它的功能并未了解透徹。最初人們僅僅把它看作是促血管形成因子，認(rèn)為具有促血管生成和增加血管通透性的功能。后來逐漸認(rèn)識(shí)到它還有其他多種功能，如在多種腫瘤細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)了它的受體，該受體可介導(dǎo)VEGF對這些細(xì)胞產(chǎn)生促生存及增加其耐藥性的作用等。本研究將已構(gòu)建的重組腺病毒Ad-VEGF<,165>和對照病毒Ad-GFP進(jìn)行擴(kuò)增和純化并將其轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的人胃癌細(xì)胞株BGC-823，觀察轉(zhuǎn)染后胃癌細(xì)胞株的

2、增殖活性及凋亡率的變化，以及探討其可能的作用機(jī)制，從而為腫瘤靶向治療策略的選擇提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。 方法：以人胚腎293細(xì)胞對重組腺病毒Ad-VEGF<,165>和對照病毒Ad-GFP進(jìn)行包裝、擴(kuò)增、純化后進(jìn)行滴度測定。然后以不同感染復(fù)數(shù)(MOI)的對照病毒體外轉(zhuǎn)染BGC-823細(xì)胞，根據(jù)熒光蛋白表達(dá)情況計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。再以適當(dāng)感染復(fù)數(shù)的對照病毒Ad-GFP和重組腺病毒Ad-VEGF<,165>轉(zhuǎn)染BGC-823細(xì)胞，應(yīng)用四唑氮

3、藍(lán)還原法(MTT)分析VEGF<,165>基因?qū)υ摲N細(xì)胞體外增殖的影響，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡的百分率，RT-PCR方法檢測VEGFmRNA、VEGF的主要受體VEGFR-2mRNA及凋亡抑制基因Bcl-2mRNA的表達(dá)，并以免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測該種細(xì)胞VEGF、VEGFR-2、Bcl-2及Ki-67蛋白的表達(dá)情況。 結(jié)果：成功擴(kuò)增及純化了重組腺病毒Ad-VEGF<,165>及對照病毒Ad-GFP，獲得約3.2×10<'13>p

4、fu/L滴度的重組腺病毒和2.0×10<'13>pfu/L滴度的對照病毒。當(dāng)感染復(fù)數(shù)(MOI)為20時(shí)，轉(zhuǎn)染率即接近100％而無明顯細(xì)胞中毒現(xiàn)象。MTT結(jié)果顯示Ad-VEGF<,165>組吸光度明顯高于Ad-GFP組(24小時(shí)：0.960±0.01 vs 0.737±0.01，P<0.001；48小時(shí)：1.321±0.03 vs 0.981±0.02，P<0.001；72小時(shí)：1.663±0.03 vs 1.207±0.01，P<0.0

5、01)及對照組(24小時(shí)：0.960±0.01 vs 0.724±0.03，P<0.001；48小時(shí)：1.321±0.03 vs 0.968±0.01，P<0.001；72小時(shí)：1.663±0.03 vs 1.185±0.02，P<0.001)；流式細(xì)胞儀測定顯示Ad-VEGF<,165>組的細(xì)胞凋亡率(％)明顯低于Ad-GFP組(4.6±0.31 vs 8.37±1.06，P<0.01)和對照組(4.6±0.31 vs 7.73±0.

6、86，P<0.01)；RT-PCR結(jié)果顯示VEGF<,165>轉(zhuǎn)染BGC-823細(xì)胞后促進(jìn)了細(xì)胞VEGF<,165>mRNA、VEGFR-2mRNA及Bcl-2mRNA的表達(dá)(P<0.05)。另外，通過免疫細(xì)胞化學(xué)方法在該細(xì)胞株上檢測到了VEGFR-2的表達(dá)，且在Ad-VEGF<,165>組的表達(dá)強(qiáng)度高于Ad-GFP組和對照組，VEGF、Bcl-2及Ki-67在三組中表達(dá)的特點(diǎn)與VEGFR-2基本相同。 結(jié)論：VEGF對體外培養(yǎng)