1、傳統(tǒng)觀念認(rèn)為成年哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)不具備再生能力，這意味著成年動(dòng)物腦和脊髓內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞只能因損傷、疾病、自然凋亡等因素逐漸減少，而不能被更新或替代。神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)打破了這一傳統(tǒng)觀念，十幾年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)：成年哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的特定部位存在神經(jīng)干細(xì)胞，在體外通過(guò)無(wú)血清培養(yǎng)，在細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)因子的作用下能夠增殖，形成神經(jīng)球并可以連續(xù)傳代擴(kuò)增，在血清等因子誘導(dǎo)下能夠分化成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。神經(jīng)干細(xì)胞在體內(nèi)平時(shí)處于相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)

2、，在腦損傷等刺激因素作用下能夠增殖、遷移、并分化為神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，起到相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。創(chuàng)傷性顱腦損傷嚴(yán)重影響人類(lèi)健康，造成沉重的社會(huì)負(fù)擔(dān)，是臨床醫(yī)生以及基礎(chǔ)研究工作者面臨的嚴(yán)峻課題，神經(jīng)干細(xì)胞移植治療創(chuàng)傷性顱腦損傷前景廣闊。神經(jīng)干細(xì)胞研究急需解決的問(wèn)題是：建立完善的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)方法；深入了解神經(jīng)干細(xì)胞的特性、分化機(jī)理及其與祖細(xì)胞的區(qū)別；定向誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化成為目的神經(jīng)細(xì)胞；深入了解神經(jīng)干細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的分化特點(diǎn)；選擇恰

3、當(dāng)?shù)纳窠?jīng)干細(xì)胞進(jìn)行移植，以實(shí)現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能重建和解剖重建。 第一部分 胚胎大鼠神經(jīng)干細(xì)胞體外培養(yǎng)分化的研究 目的 探討神經(jīng)干細(xì)胞的原代培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)方法，觀察神經(jīng)干細(xì)胞增殖、傳代和分化的規(guī)律；比較不同部位、不同胎齡來(lái)源的神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、傳代和分化的差別；比較不同細(xì)胞因子對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化的影響，建立比較完善的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)方法。為深入研究神經(jīng)干細(xì)胞的特性、分化機(jī)理、定向誘導(dǎo)分化提供基礎(chǔ)。

4、 方法 取12天胎齡的大鼠前腦中線部位的腦組織進(jìn)行原代培養(yǎng)，分別取16天胎齡的大鼠大腦皮層、海馬、紋狀體和腦室下區(qū)進(jìn)行原代培養(yǎng)，觀察神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、傳代及分化；比較不同胎齡來(lái)源的神經(jīng)干細(xì)胞增殖和傳代能力的差別。比較相同胎齡、不同部位來(lái)源的神經(jīng)干細(xì)胞增殖和傳代能力的差別。分別使用EGF、bFGF和EGF+bFG刺激細(xì)胞增長(zhǎng)，觀察神經(jīng)球形成率、神經(jīng)球直徑，MTT法觀察不同細(xì)胞因子對(duì)細(xì)胞增殖率的影響。EGF+bFG刺激下對(duì)神經(jīng)干細(xì)

5、胞進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)，觀察神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、分化規(guī)律。采取死活細(xì)胞分離、改良神經(jīng)干細(xì)胞的原代分離方法和傳代方法以提高傳代次數(shù)。 結(jié)果 12天胎齡來(lái)源的神經(jīng)干細(xì)胞增殖活力明顯強(qiáng)于16天胎齡來(lái)源的神經(jīng)干細(xì)胞，快速分裂期出現(xiàn)早，克隆形成率高。細(xì)胞種植后24小時(shí)顯微鏡下觀察可見(jiàn)大量分裂期的神經(jīng)干細(xì)胞，細(xì)胞呈對(duì)稱(chēng)或不對(duì)稱(chēng)分裂，呈啞鈴狀，連續(xù)觀察可見(jiàn)細(xì)胞分裂成兩個(gè)完全獨(dú)立的神經(jīng)干細(xì)胞。如果胰蛋白酶消化過(guò)度或者滴管吹打用力過(guò)大，細(xì)胞增殖

6、活力就會(huì)受到影響，最遲在細(xì)胞種植后5-7天才能看到大量細(xì)胞分裂相。隨后神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)入快速增殖期，形成3-6個(gè)疏松連接的細(xì)胞團(tuán)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞不斷分裂，神經(jīng)球逐漸增大，細(xì)胞之間結(jié)合更加緊密，細(xì)胞光亮，折光性好，核、漿比例大。12天胎齡大鼠來(lái)源的神經(jīng)干細(xì)胞可培養(yǎng)4個(gè)月，傳代14一16次。孕齡相同，而取材部位不同，其神經(jīng)干細(xì)胞的增殖活力和傳代次數(shù)也不相同。取材于孕16天的胎鼠腦室下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞可培養(yǎng)2個(gè)月，傳代6-10次；而取材于孕16

7、天胎鼠大腦皮層的神經(jīng)干細(xì)胞可培養(yǎng)1個(gè)月，傳代4-6次。隨著傳代次數(shù)的增多，培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，形成“克隆球”的能力明顯減低，細(xì)胞增殖緩慢，細(xì)胞透光度下降，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)顆粒，大部分神經(jīng)球停止增殖，神經(jīng)球出現(xiàn)毛狀突起，貼壁生長(zhǎng)，部分細(xì)胞從神經(jīng)球內(nèi)向外遷移生長(zhǎng)，并形成突起，向神經(jīng)細(xì)胞分化，此時(shí)強(qiáng)力振蕩培養(yǎng)瓶，神經(jīng)球仍可脫離瓶底，突起的細(xì)胞回縮，形成典型神經(jīng)球，但是難以阻止神經(jīng)球貼壁分化的過(guò)程。取未貼壁生長(zhǎng)的神經(jīng)球繼續(xù)傳代，還可以傳代2-4次，但是

8、增殖能力下降，貼壁分化加速，最終無(wú)法繼續(xù)傳代。根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明EGF和bFGF刺激神經(jīng)干細(xì)胞增殖，無(wú)EGF和bFGF的DMEM/F12培養(yǎng)液中，神經(jīng)干細(xì)胞逐漸凋亡，活細(xì)胞數(shù)量呈下降趨勢(shì)，EGF能夠刺激神經(jīng)干細(xì)胞增殖，但是相對(duì)于bFGF其增殖作用較弱，bFGF組與EGF+bFGF組比較，刺激細(xì)胞增殖的作用沒(méi)有明顯差別。2-4天細(xì)胞生長(zhǎng)活躍，此后細(xì)胞增殖趨緩。神經(jīng)干細(xì)胞在細(xì)胞分化液中培養(yǎng)，細(xì)胞2小時(shí)后貼壁，逐漸形成突起，隨著培養(yǎng)時(shí)間延

9、長(zhǎng)，突起逐漸延長(zhǎng)，顯微鏡下呈現(xiàn)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)，部分神經(jīng)元的軸突舍近求遠(yuǎn)，與100μm以外的細(xì)胞形成突觸聯(lián)系。培養(yǎng)10天左右，細(xì)胞之間形成廣泛網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系。免疫組織化學(xué)染色大部分細(xì)胞GFAP陽(yáng)性，少量細(xì)胞NF、NSE或MBP陽(yáng)性。 結(jié)論 胎齡越小，從中分離出的神經(jīng)干細(xì)胞增殖能力越強(qiáng)，傳代次數(shù)越多；相同胎齡，從腦室下區(qū)分離的神經(jīng)干細(xì)胞傳代次數(shù)和增殖活性明顯強(qiáng)于從海馬、紋狀體、皮層分離的神經(jīng)干細(xì)胞；bFGF刺激神經(jīng)干細(xì)胞增殖

10、的能力明顯強(qiáng)于EGF；神經(jīng)干細(xì)胞存在固有的增殖分化規(guī)律，類(lèi)似于胚胎中樞神經(jīng)系統(tǒng)自然發(fā)育過(guò)程，培養(yǎng)方法的改進(jìn)和細(xì)胞因子的刺激只能部分影響神經(jīng)干細(xì)胞的成熟過(guò)程。隨著傳代次數(shù)的增加神經(jīng)干細(xì)胞自然走向分化、停止增殖。 第二部分 神經(jīng)干細(xì)胞移植治療大鼠液壓打擊腦損傷的實(shí)驗(yàn)研究 目的 研究成年大鼠運(yùn)動(dòng)區(qū)液壓打擊損傷后，采用立體定向腦內(nèi)注射法，將運(yùn)動(dòng)皮層來(lái)源的神經(jīng)干細(xì)胞移植到運(yùn)動(dòng)皮層損傷灶，與海馬來(lái)源的神經(jīng)干細(xì)胞運(yùn)動(dòng)

11、區(qū)移植進(jìn)行比較，觀察神經(jīng)干細(xì)胞原位移植后移植細(xì)胞的成活、分化以及大鼠神經(jīng)功能改善情況，探討神經(jīng)干細(xì)胞原位移植的優(yōu)越性。腦損傷灶內(nèi)注射bFGF，與神經(jīng)干細(xì)胞移植進(jìn)行比較，觀察細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)因子治療創(chuàng)傷性顱腦損傷的作用，進(jìn)而探討創(chuàng)傷性顱腦損傷的修復(fù)機(jī)理，探索創(chuàng)傷性顱腦損傷更有效的治療方法。 方法 取18天胎齡的大鼠的運(yùn)動(dòng)皮層和海馬分別進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞原代培養(yǎng)，傳代一次，在干細(xì)胞增殖活躍期進(jìn)行BrdU標(biāo)記。選取成年雄性大鼠48只，分為

12、對(duì)照組、皮層干細(xì)胞移植組、海馬干細(xì)胞移的植組以及bFGF治療組，運(yùn)動(dòng)區(qū)液壓打擊腦損傷3天后，分別進(jìn)行損傷灶內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞移植和bFGF注射，治療后1、3、6、12周觀察行走試驗(yàn)、平衡試驗(yàn)以及走迷宮試驗(yàn)，比較各組神經(jīng)功能改善情況。進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)，采取ABC法進(jìn)行Brdu、NF、GFAP、Nestin、MBP染色，并進(jìn)行HE染色觀察腦損傷情況以及損傷灶的修復(fù)情況。 結(jié)果 行走試驗(yàn)：移植前各組行走試驗(yàn)平均19秒左右，無(wú)顯著

13、差異，治療后一周各組大鼠行走功能均有明顯改善，其中bFGF組的功能改善尤為顯著，與對(duì)照組比較，海馬干細(xì)胞組和皮層干細(xì)胞組也有顯著改善(P＜0.01)。移植3周以后，各組行走功能繼續(xù)改善，皮層干細(xì)胞組的改善明顯強(qiáng)于其他各組，海馬干細(xì)胞組和bFGF組的后期療效與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P＞0.05)。平衡試驗(yàn)：移植前各組大鼠評(píng)分平均5-6分，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，移植后第一周各組大鼠平衡功能明顯改善，其中bFGF組功能改善優(yōu)于對(duì)照組和海馬干細(xì)胞移植組(P

14、＜0.01)，相差非常顯著，皮層干細(xì)胞移植組的功能改善優(yōu)于對(duì)照組(P＜0.05)。第三周開(kāi)始皮層干細(xì)胞移植組優(yōu)于其他三組，持續(xù)至第12周(P＜0.01)。其他三組之間恢復(fù)無(wú)差異。記憶試驗(yàn)：移植前各組大鼠記憶能力無(wú)顯著差異，移植后第一周，各組大鼠記憶力顯著改善，bFGF組大鼠記憶能力顯著優(yōu)于其他各組(P＜0.05)，后期恢復(fù)過(guò)程中，皮層于細(xì)胞移植組和海馬干細(xì)胞移植組記憶力略優(yōu)于對(duì)照組(P＞0.05)，各組記憶能力無(wú)顯著差異。免疫組織化學(xué)檢

15、測(cè)：移植后1周，免疫組織化學(xué)染色顯示BrDU陽(yáng)性細(xì)胞存活，呈圓形或橢圓形棕褐色細(xì)胞，細(xì)胞存在于移植部位，未見(jiàn)細(xì)胞遷移。移植后3周，移植細(xì)胞仍然存活，而且BrDU陽(yáng)性細(xì)胞向移植部位以外遷移，連續(xù)切片法顯示移植細(xì)胞表達(dá)GFAP和NeuN，GFAP陽(yáng)性細(xì)胞較多，移植細(xì)胞團(tuán)中nestin陽(yáng)性細(xì)胞基本消失。 結(jié)論 細(xì)胞因子損傷灶內(nèi)注射以及神經(jīng)干細(xì)胞損傷灶內(nèi)移植都能改善創(chuàng)傷性腦損傷后的運(yùn)動(dòng)功能。神經(jīng)干細(xì)胞存在固有的分化規(guī)律，腦內(nèi)移植