1、背景
　　同種異體輸血(allogeneicbloodtransfusion,ABT)在臨床搶救病人過程中發(fā)揮著重要作用,但同種異體輸血在挽救生命的同時(shí),也會(huì)并發(fā)很多免疫相關(guān)的副反應(yīng)。輸血相關(guān)免疫調(diào)節(jié)(transfusion-relatedimmunomodulation,TRIM)[1]是輸入同種異體血液導(dǎo)致免疫系統(tǒng)改變的以免疫抑制為特征的綜合征,臨床常見的并發(fā)TRIM導(dǎo)致免疫抑制的嚴(yán)重后果為術(shù)后感染和腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移。懸浮紅細(xì)

2、胞在保存過程中,含有的白細(xì)胞及血小板可以釋放多種生物活性物質(zhì),這些生物活性物質(zhì)的濃度會(huì)隨著保存時(shí)間的延長而升高,當(dāng)這些生物活性物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體后有可能導(dǎo)致受者免疫狀態(tài)發(fā)生改變,導(dǎo)致TRIM的后果。
　　TRIM發(fā)生的確切機(jī)制尚不清楚。目前的研究已知,各種刺激信號(hào)必須與其相應(yīng)靶細(xì)胞膜上的受體結(jié)合,通過其特定的信號(hào)傳導(dǎo)通路發(fā)揮生物學(xué)作用。最近的研究中發(fā)現(xiàn)血小板不僅在止血和凝血過程中發(fā)揮重要作用,血小板還參與了很多炎癥反應(yīng)。血小板是外周血體

3、積最小的血細(xì)胞,由巨核細(xì)胞的胞漿部分脫落形成,含有致密顆粒和α顆粒,激活后可以釋放多種細(xì)胞因子和生長因子,如可溶性CD40配體(sCD40L)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGFβ)、RANTES等。在紅細(xì)胞保存過程中,血小板非常容易活化,從而釋放大量生物活性因子,關(guān)于這些生物活性因子在TRIM中的作用,,國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較少。
　　目的探討血小板在輸注庫存紅細(xì)胞增強(qiáng)患者炎癥反應(yīng)中

4、的作用及機(jī)制。
　　方法
　　1.庫存紅細(xì)胞上清制備:
　　取新鮮采集懸浮紅細(xì)胞3袋,用無菌接合機(jī)與無菌空袋接合混合后,放置在4℃冰箱中保存。分別于7d、21d、35d用無菌接合機(jī)與無菌空袋接合留取樣本,通過4000g離心,將紅細(xì)胞上層液體擠入無菌空袋,得到含有少量紅細(xì)胞的上清,大約130ml。將此上清以無菌的方式倒入無菌EP管中,以10000g離心,以去除紅細(xì)胞,得到紅細(xì)胞上清。將此上清分裝成6分,放入-80℃冰箱保

5、存。
　　2.實(shí)驗(yàn)分組:
　　將150ml新采集的機(jī)采血小板用同型血漿稀釋后,用無菌接合機(jī)與血小板保存袋連接擠入40ml血小板,依此方法再重復(fù)12次。任選其中4袋血小板以無菌的方式全部加入7d庫存紅細(xì)胞上清5ml,然后將其中3袋分別以無菌方式加入濃度10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml的LPS45ul并標(biāo)記好。再選剩余血小板中4袋血小板以無菌的方式全部加入28d庫存紅細(xì)胞上清5ml,然后將其中3袋分別以無菌方

6、式加入45ul濃度10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml的LPS并標(biāo)記好。再選剩余血小板中4袋血小板以無菌的方式全部加入35d庫存紅細(xì)胞上清5ml,然后將其中3袋分別以無菌方式加入45μl濃度10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml的LPS并標(biāo)記好。最后剩下一袋血小板什么都不加,即:
　　A組:對(duì)照組,稀釋后的機(jī)采血小板40ml。
　　B組:加入5ml7d或21d或35d紅細(xì)胞上清的45ml機(jī)采血小

7、板。
　　C組:加入5ml7d或21d或35d紅細(xì)胞上清和45μl濃度為10ng/ml的LPS
　　D組:加入5ml7d或21d或35d紅細(xì)胞上清和45μl濃度為100ng/ml的LPS
　　E組:加入5ml7d或21d或35d紅細(xì)胞上清和45μl濃度為1000ng/ml的LPS
　　3.結(jié)果檢測(cè):
　　分別于3h、6h、24h以無菌方式在血小板中取出10ml,其中1ml用于血小板凋亡、活化檢測(cè),2ml用于

8、細(xì)胞因子檢測(cè),其余用于血小板聚集率及低滲性休克檢測(cè)。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD62P及血小板凋亡;血小板低滲休克反應(yīng)采用分光光度法檢測(cè);血小板聚集率使用血小板聚集儀檢測(cè);CD40L、5-HT、TGF-β1、RANTES、IL-1β、TNF-α使用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)。
　　結(jié)果
　　1.sCD40L檢測(cè)結(jié)果
　　在各組加入不同庫存紅細(xì)胞上清孵育后相同檢測(cè)時(shí)間點(diǎn),sCD40L濃度隨庫存紅細(xì)胞上清時(shí)間延長而增加(P<0.05);

9、在相同庫存紅細(xì)胞上清中,sCD40L濃度隨血小板保存時(shí)間延長而增加(P<0.05);在同等條件下,sCD40L濃度隨溶液中LPS濃度增加而增加(P<0.05)。
　　2.5-HT檢測(cè)結(jié)果
　　在各組加入不同庫存紅細(xì)胞上清孵育后相同檢測(cè)時(shí)間點(diǎn),5-HT濃度隨庫存紅細(xì)胞上清時(shí)間延長而增加(P<0.05);在相同庫存紅細(xì)胞上清中,5-HT濃度隨血小板保存時(shí)間延長而增加(P<0.05);在同等條件下,5-HT濃度隨溶液中LPS濃度增

10、加而增加(P<0.05)。
　　3.TGF-β1檢測(cè)結(jié)果
　　在各組加入不同庫存紅細(xì)胞上清孵育后相同檢測(cè)時(shí)間點(diǎn),TGF-β1濃度隨庫存紅細(xì)胞上清時(shí)間延長而增加(P<0.05),在相同庫存紅細(xì)胞上清中,TGF-β1的釋放在3h、6h處沒有差別(P>0.05),在7d紅細(xì)胞上清的刺激下TGF-β1的釋放并沒有隨時(shí)間的延長而增加(P>0.05)),但在21d、35d紅細(xì)胞上清刺激下,TGF-β1在24h處釋放明顯增加(P<0.05

11、);在同等條件下,TGF-β1濃度隨溶液中LPS濃度增加而增加(P<0.05)。
　　4.RANTES檢測(cè)結(jié)果
　　在各組加入不同庫存紅細(xì)胞上清孵育后相同檢測(cè)時(shí)間點(diǎn),RANTES濃度隨庫存紅細(xì)胞上清時(shí)間延長而增加(P<0.05),在相同庫存紅細(xì)胞上清中,RANTES的釋放在6h、24h處沒有差別(P>0.05),但與3h相比差異明顯(P<0.05)。在同等條件下,RANTES濃度隨溶液中LPS濃度增加而增加(P<0.05)。

12、
　　5.IL-1β檢測(cè)結(jié)果
　　在7d上清刺激下,IL-1β的釋放隨保存時(shí)間延長而增加(P<0.05);在21d、35d上清刺激下,3h、6h處IL-1β的釋放并未隨時(shí)間延長而增加(P>0.05),但在24h處IL-1β的釋放隨時(shí)間延長而增加(P<0.05)。在各組加入不同庫存紅細(xì)胞上清孵育后相同檢測(cè)時(shí)間點(diǎn),IL-1β的釋放隨保存紅細(xì)胞上清時(shí)間延長而增加(P<0.05)。在同等條件下,IL-1β的濃度隨溶液中LPS濃度增加

13、而增加(P<0.05)。
　　6.CD62檢測(cè)結(jié)果
　　在7d上清刺激下,CD62P的表達(dá)在6h、24h處并未隨時(shí)間延長而增加(P>0.05);在21d、35d上清刺激下,CD62P的表達(dá)隨時(shí)間延長而增加(P<0.05)。在同等條件下,CD62P的表達(dá)隨溶液中LPS濃度增加而增加(P<0.05)。
　　7.血小板聚集率檢測(cè)
　　在各組加入不同庫存紅細(xì)胞上清孵育后相同檢測(cè)時(shí)間點(diǎn),血小板聚集率隨庫存紅細(xì)胞上清時(shí)間延長

14、而降低(P<0.05),在相同庫存紅細(xì)胞上清中,血小板聚集率隨庫存紅細(xì)胞上清時(shí)間延長而降低(P<0.05);在同等條件下,血小板聚集率隨溶液中LPS濃度增加而降低(P<0.05)。
　　8.血小板低滲性休克檢測(cè)結(jié)果
　　在各組加入不同庫存紅細(xì)胞上清孵育后相同檢測(cè)時(shí)間點(diǎn),血小板低滲性休克率隨庫存紅細(xì)胞上清時(shí)間延長而降低(P<0.05);在相同庫存紅細(xì)胞上清中,血小板低滲性休克率隨庫存紅細(xì)胞上清時(shí)間延長而降低,但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

15、(P>0.05);在同等條件下,血小板低滲性休克率隨溶液中LPS濃度增加而降低(P<0.05)。
　　9.AnnexinV檢測(cè)結(jié)果
　　在各時(shí)間點(diǎn)及各紅細(xì)胞上清刺激下統(tǒng)計(jì)結(jié)果均無明顯差異(P>0.05)。
　　10.TNF-α檢測(cè)結(jié)果
　　所有樣本中均未檢測(cè)到TNF-α。
　　結(jié)論
　　1.懸浮紅細(xì)胞保存時(shí)間越長,其上清刺激血小板產(chǎn)生致炎因子的能力越強(qiáng)。
　　2.懸浮紅細(xì)胞保存時(shí)間越長,其上清對(duì)