1、目的: 觀察中藥復(fù)方消可寧顆粒對(duì)高糖培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(ECV-304)生長(zhǎng)的影響，針對(duì)高糖對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷機(jī)制，初步探討消可寧是否具有抗氧化應(yīng)激保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用及可能機(jī)制。 方法: 1.體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(ECV-304)，分為七組：常規(guī)培養(yǎng)組：葡萄糖濃度為5.5mM；高糖對(duì)照組：葡萄糖濃度為30mM；不同濃度消可寧組(消可寧濃度按生藥計(jì)算，分別配制成終濃度為20g/L、40g/L、60g/L、80

2、g/L、100g/L，葡萄糖濃度為30mM)；分別培養(yǎng)12、24、48小時(shí)。 2.細(xì)胞HE染色，觀察細(xì)胞的形態(tài)變化。 3.采用四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)比色法測(cè)定細(xì)胞增殖活性，觀察高糖以及不同濃度消可寧對(duì)ECV-304細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。 4.生化測(cè)定細(xì)胞上清液中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、超氧陰離子(supeoxide，

3、O2)、黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XOD)及總一氧化氮合酶(total nitric oxide synthase，TNOS)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(induce nitric oxidesynthase，iNOS)、一氧化氮(nitric oxide，NO)的活性或含量。 5.免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組細(xì)胞中過(guò)氧亞硝酸陰離子(peroxynititrite，ONOO)生成標(biāo)記物--硝基酪氨酸(nitrotyro

4、sine，NT)。6.Western blot測(cè)定各組細(xì)胞上清液中內(nèi)皮細(xì)胞型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)蛋白表達(dá)。 結(jié)果: 1.各組內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)觀察，細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)，高糖對(duì)照組細(xì)胞變小變圓，部分細(xì)胞脫落，隨消可寧劑量增大，作用時(shí)間延長(zhǎng)，上述現(xiàn)象逐漸減少。 2.MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：高糖引起ECV-304細(xì)胞生長(zhǎng)抑制，消可寧則可減輕其抑制，但只有在消可

5、寧作用48h時(shí)出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與常規(guī)培養(yǎng)組相比，高糖對(duì)照組及20～60g/L消可寧組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率均較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t分別為4.5755，4.2092及3.2561，P<0.05或<0.01)。80、100g/L消可寧組減輕高糖對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為2.9077，3.5128；P<0.05)，而與常規(guī)培養(yǎng)組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.6678，1.0627；P>0.05)。 3.各組生化指標(biāo)

6、改變：(1)與常規(guī)培養(yǎng)組比較，其余各組內(nèi)皮細(xì)胞SOD活力均減低，XOD活性及O2-均有升高，以高糖對(duì)照組尤為明顯，各消可寧組SOD活力有所恢復(fù)，XOD活性及O2-較高糖對(duì)照組減低，并具劑量和時(shí)間依賴(lài)性。O2-與SOD和XOD的相關(guān)性分析顯示，與SOD成負(fù)相關(guān)(r=-0.838，P<0.01)，與XOD呈正相關(guān)(r=0.606，P<0.01)；(2)高糖對(duì)照組中eNOS活力降低、iNOS活力升高和NO產(chǎn)生增加最為明顯，消可寧組細(xì)胞eNOS

7、活力有所恢復(fù)，iNOS活力及NO得到有效控制，且具有劑量時(shí)間依賴(lài)性。 4.免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示：與常規(guī)對(duì)照組比較，高糖對(duì)照組內(nèi)皮細(xì)胞中NT的表達(dá)率高，隨著消可寧濃度的增加，NT表達(dá)率逐漸減少，100g/L消可寧組細(xì)胞中NT表達(dá)率較常規(guī)對(duì)照組的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 5.Western blot蛋白測(cè)定結(jié)果顯示：高糖對(duì)照組eNOS蛋白的含量最低并具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，消可寧各組細(xì)胞總蛋白中eNOS

8、蛋白的含量恢復(fù)或增加。 結(jié)論: 1.高糖引起ECV-304細(xì)胞氧化損傷，對(duì)其生長(zhǎng)具有明顯抑制作用，并具有時(shí)間依賴(lài)性；而消可寧可以減輕高糖對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，并具有濃度和時(shí)間依賴(lài)性。 2.消可寧具有抗氧化作用，對(duì)高糖狀態(tài)下ECV-304細(xì)胞保護(hù)機(jī)制可能為：(1)消可寧有效的抑制細(xì)胞內(nèi)XOD活性、減少了O2-產(chǎn)生，同時(shí)提高了SOD活性，促進(jìn)O2-清除；(2)消可寧在一定程度上能夠恢復(fù)eNOS活性，抑制