原癌基因C-met基因在食管鱗癌中的表達(dá)及其與COX-2表達(dá)相關(guān)性以及COX-2基因表達(dá)與細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)性研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:
   食管癌是消化道常見惡性腫瘤之一,其發(fā)病過程中存在許多原癌基因的激活。C-met是一種由C-met原癌基因編碼的蛋白產(chǎn)物,為肝細(xì)胞生長因子受體,具有酪氨酸激酶活性,與多種癌基因產(chǎn)物和調(diào)節(jié)蛋白相關(guān),參與細(xì)胞信息傳導(dǎo)、細(xì)胞骨架重排的調(diào)控,是細(xì)胞增殖、分化和運(yùn)動(dòng)的重要因素。目前研究表明,C-met基因與多種惡性腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移密切相關(guān),許多腫瘤病人在其腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程中均有C-met的過度表達(dá)和基因擴(kuò)增。
  

2、 當(dāng)前國內(nèi)外文獻(xiàn)食管鱗癌中C-met表達(dá)情況報(bào)道較少,因此,本實(shí)驗(yàn)通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)技術(shù)檢測(cè)57例食管鱗癌組織和20例癌旁正常食管組織中C-met mRNA的表達(dá),并分析C-met mRNA的表達(dá)與臨床病理資料之間的關(guān)系:同時(shí)采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)了57例食管鱗癌組織和20例癌旁正常食管組織中C-met蛋白及COX-2

3、蛋白的表達(dá),并探討C-met蛋白與COX-2蛋白之間的關(guān)系。本研究還應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù),對(duì)食管鱗癌細(xì)胞的增殖活性和凋亡水平進(jìn)行檢驗(yàn)分析,希望證實(shí)COX-2表達(dá)與食管腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡有關(guān)。
   材料與方法
   一、實(shí)驗(yàn)材料
   57例食管鱗癌手術(shù)標(biāo)本及部分相應(yīng)的癌旁正常食管組織標(biāo)本20例來自山東大學(xué)省立醫(yī)院胸外科2008年11月-2009年12月間的手術(shù)病例,其中男性46例,女性11例,年齡34~72歲,中位

4、年齡52.9歲。57例腫瘤組織中,13例低分化,28例中分化,16例高分化,26例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。腫瘤部位中段28例,下段29例。腫瘤大小≤5cm32例,>5cm25例。根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟(UICC)1997年修訂的食管癌臨床分期標(biāo)準(zhǔn),Ⅱa期31例,Ⅱb+Ⅲ期26例,食管上段、T4及M1(Ⅳ期)病人不包括在手術(shù)范圍內(nèi)。胸腹部淋巴結(jié)清掃范圍參照美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)(American Joint Committee on Cancer,AJCC)

5、食管癌淋巴結(jié)分布圖,淋巴結(jié)清掃數(shù)目7~22枚,平均9.6枚。所有患者術(shù)中肉眼大體判斷均達(dá)RO切除,術(shù)后病理論斷食管鱗癌,食管上、下切緣均無腫瘤細(xì)胞殘留。相應(yīng)的癌旁正常食管組織標(biāo)本為術(shù)中采集距離食管癌組織至少5cm以上的正常食管組織。所有患者術(shù)前均未行放、化療治療。
   二、實(shí)驗(yàn)方法
   1、逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)C-met基因表達(dá)
   取100mg待檢驗(yàn)組織,加入1ml Trizol溶液徹底勻漿。參照Trizol

6、試劑盒說明書用一步法提取總RNA,用DNA/RNA測(cè)定儀測(cè)定RNA濃度和純度。反應(yīng)體系中力口入10×RNA PCR Buffer1μl、dNTP1μl、MgCl22μl、Random9mers0.5μl、RNA1μl、RNase inhibitor0.25μl、Reverse Transcriptase0.5μl、ddH2O3.75μl。反應(yīng)條件:30℃10min,42℃30min,99℃5min,5℃5min。
   C-me

7、t基因引物序列為5’-TTCACCGCGGAAACACCCATC-3’(上游)和5’-GTCTTCCAGCCAGGCCCAGT-3’(下游)。在12.5μl反應(yīng)體系中含有滅菌ddH2O
   7.16μl、20pmol/L上、下游引物各0.15μl、cDNA2.5μl、Taq Hs0.04μl、5×Buffer2.5μl。反應(yīng)條件:95℃2min,95℃1min,58℃1min,72℃1min,30個(gè)循環(huán);72℃延伸7min。用

8、內(nèi)參照β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)檢測(cè)逆轉(zhuǎn)錄效率。PCR產(chǎn)物用8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳,100V,1.5h,電泳結(jié)束后,凝膠自動(dòng)成像儀進(jìn)行攝像分析。采用TaKaRa公司100bp梯度Makers為分子量大小對(duì)照,確定電泳條帶。
   2、免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)C-met、COX-2蛋白表達(dá)
   采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶連接(Streptavidin-peroxidase S-P)免疫組織化學(xué)方法,一抗C-met

9、和COX-2兔抗人多克隆抗體(美國BIOCHEMICALS公司產(chǎn)品),工作濃度1:100,S-P試劑盒購自北京中山公司。實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。將已知陽性胃癌切片為陽性對(duì)照,用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。胞漿染色為淡黃至棕黃色者為陽性細(xì)胞標(biāo)志,將陽性細(xì)胞按其數(shù)量及顯色強(qiáng)度分為3級(jí):弱陽性(+)、陽性(++)和強(qiáng)陽性(+++)。
   3、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)食管鱗癌細(xì)胞的增殖活性和凋亡水平
   取材深低溫保存的組織

10、,采用網(wǎng)挫方法制備單細(xì)胞懸液,以PBS調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106/ml。其中一份加入PI染色液1ml(PI染色液包含PI5mg,Rnase2mg,TritonX-1001ml,生理鹽水65ml,枸椽酸鈉100mg,加蒸餾水至100ml),置4℃冰箱中避光染色30min后進(jìn)行分析。另一份加入FITC-AnnexinV及PI各5μl,室溫下避光靜置15min后進(jìn)行分析。
   使用的流式細(xì)胞儀為FACSCalibur型(B.D,USA)

11、。光源為488nm氬離子激光器,FITC受激發(fā)后發(fā)綠色熒光,PI發(fā)紅色熒光,每份標(biāo)本計(jì)數(shù)10000個(gè)細(xì)胞,然后在Macintosh9.5計(jì)算機(jī)上用相關(guān)軟件分析數(shù)據(jù)。測(cè)量前,以人淋巴細(xì)胞作為標(biāo)準(zhǔn)品調(diào)校儀器的CV值在3.0%以內(nèi)。應(yīng)用MetaMorph(CellQuest3.0)細(xì)胞周期分析軟件,計(jì)算DNA組方圖各時(shí)相分布的百分比,以增殖指數(shù)(proliferationindex,PI)表示增殖活性。二維點(diǎn)陣圖上FITC高染而PI低染者為早

12、期凋亡細(xì)胞,計(jì)算其所占的百分比。
   三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
   計(jì)數(shù)資料采用X2檢驗(yàn),計(jì)量資料采用t檢驗(yàn),用SPSS13.0軟件處理。
   結(jié)果
   1、C-met基因在食管鱗癌組織中的表達(dá)情況
   C-met基因在57例食管鱗癌組織中陽性表達(dá)率為52.6%(30/57),而在20例癌旁正常食管組織中低表達(dá),陽性率為5.0%(1/20),兩者之間有顯著性差異(P<0.01)。
   2

13、、C-met基因的表達(dá)與食管鱗癌組織臨床病理資料的關(guān)系
   C-met基因的表達(dá)與食管鱗癌患者的年齡、性別、病變長度和癌組織分化程度無關(guān)(P>0.05),而與鱗癌組織浸潤深度(P<0.05)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)(P<0.01)。
   3、食管鱗癌組織中C-met蛋白表達(dá)與COX-2蛋白表達(dá)的相關(guān)性
   C-met蛋白在57例食管鱗癌組織中陽性表達(dá)率為52.6%(30/57),而在20例癌旁正常食管組

14、織中低表達(dá),陽性率為5.0%(1/20),兩者之間有顯著性差異(P<0.01)。在食管鱗癌組織中,C-met蛋白的表達(dá)與癌組織浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān),而與患者年齡、性別、病變長度和癌組織分化程度無關(guān)(P>0.05)。
   COX-2蛋白在57例食管鱗癌組織中有40例陽性表達(dá)(陽性率為70.2%),而20例癌旁正常組織僅1例呈陽性表達(dá)(陽性率為5.0%),兩者之間有顯著性差異(P<0.01)。在食管鱗癌組織中,CO

15、X-2蛋白的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)(P<0.05),而與患者年齡、性別、病變長度、癌組織浸潤深度和組織分化程度無關(guān)(P>0.05)。
   30例C-met蛋白表達(dá)陽性的食管鱗癌組織中有26例COX-2蛋白陽性表達(dá),27例C-met蛋白表達(dá)陰性的食管鱗癌組織中有14例COX-2蛋白呈陽性表達(dá),經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)分析,C-met蛋白表達(dá)與COX-2蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.436,x2=8.203,P=0.004)。
 

16、  4、食管鱗癌組織中COX-2基因表達(dá)與腫瘤細(xì)胞增殖的相關(guān)性
   通過免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)的57例食管鱗癌組織的細(xì)胞增殖指數(shù)(PI)平均為(30.14±4.99)%。57例患者中40例COX-2蛋白陽性表達(dá),17例COX-2蛋白陰性表達(dá),食管鱗癌細(xì)胞增殖指數(shù)(PI)分別為(31.41±5.14)%和(27.15±4.66)%,兩者比較有顯著性差異(t=6.933,p<0.01)。
   5、食管鱗癌組織中COX-2

17、基因表達(dá)與腫瘤細(xì)胞早期凋亡的相關(guān)性
   通過免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)的57例食管鱗癌組織的早期凋亡率平均為(2.18±0.78)%。57例患者中40例COX-2蛋白陽性表達(dá),17例COX-2蛋白陰性表達(dá),食管鱗癌細(xì)胞早期凋亡率分別為(1.97±0.71)%和(2.66±0.94)%,兩者比較有顯著性差異(t=4.831,,p<0.01)。
   結(jié)論
   1、C-met基因在食管鱗癌中呈高表達(dá),而在癌旁正常食管組

18、織中低表達(dá)。
   2、C-met基因的表達(dá)與食管鱗癌患者的年齡、性別、病變長度和癌組織分化程度無關(guān),而與癌組織浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)。
   3、COX-2基因在食管鱗癌中呈高表達(dá),而在癌旁正常食管組織中低表達(dá)。
   4、COX-2基因的表達(dá)與食管鱗癌患者的年齡、性別、病變長度、癌組織浸潤深度和組織分化程度無關(guān),而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)。
   5、食管鱗癌組織中C-met蛋白表達(dá)

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