1、第一部分利用二代測序技術(shù)檢測馬凡綜合征患者致病基因突變
　　目的：馬凡綜合征是一種常染色體顯性遺傳病，由于結(jié)締組織病變引起骨骼、眼部和心血管系統(tǒng)受累，易導(dǎo)致主動脈擴(kuò)張和夾層，致病基因為FBN1。TGFBR2基因發(fā)生致病突變也可以出現(xiàn)類似癥狀。我們希望通過二代測序技術(shù)檢測馬凡綜合征患者基因型，驗證臨床診斷，同時檢測二代測序技術(shù)對FBN1基因和TGFBR2基因覆蓋度、準(zhǔn)確率。
　　方法：選擇兩名根據(jù)Ghent標(biāo)準(zhǔn)確立臨床診斷的馬

2、凡綜合征患者，他們來自不同家系，經(jīng)同意后采集外周血樣本。通過Ion AmpliSeq Designer訂制功能設(shè)計專門適合馬凡綜合征患者基因檢測的多重PCR引物Panel；提取患者基因組DNA；通過PCR反應(yīng)用Panel中設(shè)計好的引物對目標(biāo)片段文庫進(jìn)行擴(kuò)增并加裝接頭；用Ion OneTouch2油包水PCR儀對文庫進(jìn)行構(gòu)建；使用Ion PGM系統(tǒng)對模版DNA測序；測序結(jié)果利用Ion Torrent平臺專屬軟件Torrent Suite

3、v4.2.1進(jìn)行處理并用多種在線軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果：通過Ion PGM二代測序儀對來自于兩個不同家族的馬凡綜合征患者基因組DNA的FBN1基因和TGFBR2基因進(jìn)行選擇性測序，平均輸出589714讀長，每個樣本命中率平均為89.87％。目標(biāo)區(qū)域平均測序深度是794層。發(fā)現(xiàn)了19個已知或者新的突變。其中第一個患者有16個突變，第二個患者有15個突變。19個突變中，12個為終止突變，2個為同義突變，5個為非同義突變，包括3個錯義突

4、變，1個無義突變以及1個移碼突變。
　　結(jié)論：通過Ion torrentPGM二代測序平臺，設(shè)計專門Panel，對馬凡綜合征患者FBN1、TGFBR2進(jìn)行基因檢測，方法可行并且具有高效，準(zhǔn)確的特點。
　　第二部分用Sanger測序法對二代測序補(bǔ)充及結(jié)果驗證
　　目的：應(yīng)用Sanger測序?qū)Χ鷾y序得到的FBN1和TGFBR2檢測結(jié)果進(jìn)行補(bǔ)充測序，同時對于二代測序發(fā)現(xiàn)的所有突變，應(yīng)用Sanger測序技術(shù)提供驗證。通過比較

5、Sanger測序與之前Ion Torrent測序結(jié)果的吻合性來評價二代測序用于檢測FBN1和TGFBR2這兩個多外顯子基因的可靠程度。同時利用一代測序?qū)ο茸C者家系成員和健康人群基因組DNA目標(biāo)片段測序并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，判斷所發(fā)現(xiàn)基因突變的致病性。
　　方法：在征得書面同意后，對所有的先證者和患者家庭成員進(jìn)行病史采集。采用統(tǒng)一問卷形式記錄患者信息，繪制家系圖。對照Ghent診斷標(biāo)準(zhǔn)為患者系統(tǒng)癥狀評分。采集患者及血親的血樣7ml進(jìn)

6、行基因檢測。同時對本院進(jìn)行健康體檢的正常人群400例基因組DNA進(jìn)行比對測序。測序完成后用Chromas3.0軟件將測序數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成可讀格式，再利用Dnaman v6.0.40軟件完成序列比對分析。根據(jù)我們采集的臨床資料結(jié)合測序結(jié)果對基因突變導(dǎo)致的生物學(xué)效應(yīng)進(jìn)行分析解釋。
　　結(jié)果：對FBN1和TGFBR2基因的補(bǔ)充測序沒有發(fā)現(xiàn)新的突變位點。通過對馬凡綜合征患者基因組 DNA的重測序，我們確認(rèn)了之前二代測序的結(jié)果。其中無義突變c.1

7、585C>T，p.Arg529X，SNP位點編號 rs137854476以及新發(fā)現(xiàn)的一個移碼突變c.6355_6356insTG，p.G2120fsX2160是致病突變，患者家庭成員中被檢測該突變的人有相應(yīng)表型特征，屬于馬凡綜合征患者。新發(fā)現(xiàn)的另一個錯義突變是良性 SNP，c.913A>G，p.Thr305Ala在患者及表型正常家屬和健康人群中檢測到。
　　結(jié)論：我們通過Sanger測序法驗證了二代測序技術(shù)對于馬凡綜合征致病基因F

8、BN1和TGFBR2檢測的有效性。通過FBN1致病基因突變的發(fā)現(xiàn)對馬凡綜合征患者進(jìn)行了確診。
　　第三部分中低溫停循環(huán)在急性A型夾層全弓置換手術(shù)當(dāng)中的應(yīng)用
　　目的：A型主動脈夾層是馬凡綜合征最嚴(yán)重的并發(fā)癥，我們采用全弓置換+象鼻支架植入的方式對其進(jìn)行治療。并在實踐中改進(jìn)方法，將停循環(huán)合并順行腦灌注進(jìn)行弓部置換時的低溫水平升高到中低溫的程度（咽溫20.1-28℃）。通過總結(jié)臨床資料，分析查找手術(shù)危險因素，評價這一手術(shù)方式對馬

9、凡綜合征患者治療的效果。
　　方法：連續(xù)收集2010年至2013年在我院心胸外科接受全弓置換手術(shù)的99名患者圍手術(shù)期資料，按照中低溫組和深低溫組分為兩組，進(jìn)行回顧性比較研究。分類變量的比較使用卡方檢驗或Fisher’s確切概率法。連續(xù)性變量使用非配對t檢驗比較，對影響30天死亡率以及神經(jīng)功能不良事件（包括一過性和永久性神經(jīng)功能損傷病例）的因素進(jìn)行Logistic回歸分析。納入回歸模型的變量和校正因子包括：年齡、性別、體重指數(shù)、高血

10、壓、糖尿病、是否為急診手術(shù)、術(shù)前左室EF值、是否患有乙肝、手術(shù)時長、體外循環(huán)時間、停循環(huán)時間、冠心病、術(shù)前休克、術(shù)前透析、體外循環(huán)時間超過40min、低溫分組（咽溫20℃分界）、術(shù)中紅細(xì)胞消耗量、術(shù)中新鮮冰凍血漿消耗量。
　　結(jié)果：全組患者采用全弓置換+象鼻支架手術(shù)治療。根部手術(shù)操作中Bentall術(shù)式占絕大多數(shù)33例（84.6%）。一過性神經(jīng)功能損傷的概率是17.2%。30天死亡人數(shù)17人。全體患者平均手術(shù)時長508.8±80.

11、0 min，平均體外循環(huán)時間227.9±37.3 min，心肌阻斷時間127.6±23.6 min，低溫停循環(huán)時間29.9±6.0min。馬凡綜合征患者5人，平均年齡30.0±7.4。接受手術(shù)的馬凡綜合征患者全部治愈出院。一人出現(xiàn)一過性神經(jīng)功能紊亂。多因素分析發(fā)現(xiàn)停循環(huán)時深低溫（咽溫14-20℃）是神經(jīng)功能損傷獨(dú)立危險因素（P=0.031; OR=0.385;95% CI=0.162-0.919）。隨訪1-4年，1人因再發(fā)B型夾層住院治