1、β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,EC3.2.1.23)可以將乳糖等含β-半乳糖苷雙糖和寡糖降解為單糖,為生物提供可利用的碳素營養(yǎng)。因?yàn)槟芩馀Ｄ讨械娜樘?β-半乳糖苷酶被廣泛的應(yīng)用于乳品工業(yè)。又因?yàn)楸憷娘@色反應(yīng)而被普遍應(yīng)用于分子生物學(xué)研究。根據(jù)氨基酸序列的相似性和系統(tǒng)進(jìn)化分析,β-半乳糖苷酶可以分別歸入糖苷水解酶1、2、35和42家族(glycoside hydrolase family,GHF)。許多細(xì)菌由一個(gè)GHF

2、-2β-半乳糖苷酶基因和其它乳糖代謝相關(guān)基因組成乳糖操縱子來利用乳糖。典型的例子就是大腸桿菌(Escherichia coli)的乳糖操縱子。某些生存于乳糖豐富環(huán)境的細(xì)菌攜帶有多個(gè)家族的β-半乳糖苷酶基因。但大多數(shù)攜帶多個(gè)β-半乳糖苷酶基因的細(xì)菌仍然由GHF-2β-半乳糖苷酶基因組成乳糖操縱子來利用乳糖。
　　 嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)是公認(rèn)安全的(GRAS)微生物,作為奶制品中的益生菌和

3、人體腸道中的正常菌群,能維持和促進(jìn)人體健康。最近其基因組被測序(GenBank accession no.CP000033),發(fā)現(xiàn)基因組上有一個(gè)不同于大腸桿菌乳糖操縱子的lac基因簇。特別的是該基因簇除擁有一個(gè)GHF-2β-半乳糖苷酶編碼基因lacLM外,還擁有一個(gè)GHF-42β-半乳糖苷酶基因lacZ。我們好奇的是這樣一個(gè)由GHF-2β-半乳糖苷酶基因和GHF-42β-半乳糖苷酶基因構(gòu)成的lac基因簇在利用乳糖上是否比典型的由一個(gè)GH

4、F-12β-半乳糖苷酶基因構(gòu)成的乳糖操縱子更有優(yōu)勢。
　　 嗜酸乳桿菌lac基因簇的LacLM是一個(gè)異源二聚體。早先發(fā)現(xiàn)的β-半乳糖苷酶都是由一個(gè)基因編碼的,近年來才發(fā)現(xiàn)了由兩個(gè)基因編碼的異源二聚體β-半乳糖苷酶。Nguyen等人提純了嗜酸乳桿菌R22菌株的該酶,并研究了酶學(xué)特性,認(rèn)為該酶可用于乳品工業(yè),可是卻沒能將其克隆表達(dá)。迄今為止,還沒有關(guān)于嗜酸乳桿菌lac基因簇的GHF-42β-半乳糖苷酶LacZ的功能研究報(bào)道。W.M.

5、Russell等人的研究間接說明lacZ基因可能是一個(gè)沉默基因。而另一個(gè)研究卻發(fā)現(xiàn)lacZ基因的轉(zhuǎn)錄水平隨乳糖誘導(dǎo)而上調(diào),所以lacZ基因編碼產(chǎn)物是否真的有功能,是否能在嗜酸乳桿菌中正常表達(dá),這兩個(gè)問題還不能下結(jié)論。如果lacZ基因的編碼產(chǎn)物的確具有β-半乳糖苷酶活性,而且能在嗜酸乳桿菌中正常表達(dá),那么該基因作為嗜酸乳桿菌lac基因簇的兩個(gè)β-半乳糖苷酶基因之一,又在嗜酸乳桿菌利用乳糖的代謝中發(fā)揮了什么樣的作用呢?
　　 為了闡

6、明嗜酸乳桿菌lac基因簇的lacZ基因的功能,以及研究LacLM和LacZ的應(yīng)用價(jià)值,本文進(jìn)行了以下研究:
　　 1、克隆表達(dá)和純化了LacZ。從嗜酸乳桿菌ATCC4356菌株的基因組中擴(kuò)增該基因,并在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了表達(dá)。在N端或C端融合His-Tag的重組LacZ都表達(dá)為無活性的包涵體,透析復(fù)性也不能恢復(fù)其活性。糖苷水解酶42家族的β-半乳糖苷酶在C端和N端都有一個(gè)保守結(jié)構(gòu)域,嗜酸乳桿菌的LacZ也不例外,His-Tag很可

7、能影響了這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的正確折疊。不融合His-Tag的重組LacZ實(shí)現(xiàn)了具有β-半乳糖苷酶活性的表達(dá)。優(yōu)化誘導(dǎo)條件后,超聲上清液比活力(ONPG)達(dá)到了1.14 U/mg。經(jīng)過硫酸銨分級沉淀、ABTG-Agrose親和層析、UnoQ陰離子交換和sephadex G200凝膠排阻四步純化,得到了電泳純的重組LacZ,比活力為43.2 U/mg。
　　 2、克隆表達(dá)和純化了LacLM。參照己全基因組測序的嗜酸乳桿菌NCFM菌株,以A

8、TCC4356菌株基因組為模板,將lacLM基因克隆到pQE31質(zhì)粒上,并在大腸桿菌JM109菌株中實(shí)現(xiàn)了可溶性表達(dá)。測序后,發(fā)現(xiàn)其大亞基512位氨基酸為精氨酸,不同于已知嗜酸乳桿菌菌株LacLM的大亞基。優(yōu)化誘導(dǎo)條件后,超聲上清液中酶活(ONPG)達(dá)到了1.30U/mg。經(jīng)過硫酸銨分級沉淀、陰離子交換、親和層析和凝膠排阻四步純化,得到了純化的β-半乳糖苷酶,比活力為226 U/mg。
　　 3、嗜酸乳桿菌β-半乳糖苷酶天然表達(dá)

9、驗(yàn)證。以重組LacZ和LacLM為marker,將誘導(dǎo)后經(jīng)硫酸銨初步純化的嗜酸乳桿菌超聲破菌上清液行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(native-PAGE),然后用固相活性染色法染色,證明嗜酸乳桿菌的這兩個(gè)β-半乳糖苷酶都能正常地被誘導(dǎo)表達(dá)。
　　 4、測定重組酶酶學(xué)特征。使用凝膠排阻的方法測得重組LacZ的表觀分子量為71.6kDa,比較理論分子量和SDS-PAGE測得的分子量,推定活性形式為單體。以O(shè)NPG為底物測得該酶的Km值和

10、Vmax分別是3.84±0.09 mmol/L和52.1±0.6 U/mg。其最適pH為6-6.6,最適溫度為36-40℃,在普通冷藏溫度4℃也能保持16.5％的活性。重組LacLM的凝膠排阻表觀分子量為96.3 kDa,比較理論分子量和SDS-PAGE測得的分子量。推定活性形式為異源二聚體。對ONPG的Km值和Vmax值分別是:2.18±0.12mmol/L和273+_5U/mg,其最適PH為7,最適溫度為49℃,在60℃時(shí)也能保持約

11、50％的活性。
　　 通過對嗜酸乳桿菌lac基因簇的lacZ基因的克隆表達(dá),我們證實(shí)lacZ基因是真基因,其編碼產(chǎn)物具有β-半乳糖苷酶活性;通過嗜酸乳桿菌β-半乳糖苷酶天然表達(dá)驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)LacZ存在于誘導(dǎo)后的嗜酸乳桿菌菌體中,這表明嗜酸乳桿菌lac基因簇的lacZ基因不僅是一個(gè)真基因而且能在嗜酸乳桿菌中正常表達(dá)。充分說明LacZ參與了嗜酸乳桿菌的乳糖利用。
　　 LacZ和LacLM的酶學(xué)性質(zhì)中區(qū)別最大的是溫度范圍。La

12、cZ最適溫度為36-40℃,在低至4℃的溫度下也能保持16.5％的活性,在高溫下活性較差,溫度升至55℃時(shí),就基本喪失了活性;而LacLM的最適溫度為49℃,在低溫下活性很弱,在4℃,基本不表現(xiàn)活性,在高溫下活性良好,溫度升至60℃時(shí)也能保持約50％的活性。可以推測,當(dāng)嗜酸乳桿菌在在低溫環(huán)境(如:冷藏柜、泡菜壇)中生存時(shí),由LacZ來降解乳糖;在中溫環(huán)境(如:人體腸道)中生存時(shí),兩個(gè)酶共同參與降解乳糖;在高溫環(huán)境(如:奶酪發(fā)酵,酸奶發(fā)酵

13、)中則由LacLM降解乳糖。嗜酸乳桿菌lac基因簇不像大腸桿菌的乳糖操縱子只有一個(gè)GHF-2β-半乳糖苷酶,還有GHF-42β-半乳糖苷酶。其原因可能就是為了適應(yīng)溫度變化,使該菌利用乳糖的溫度范圍變得更寬,在低溫下也能利用乳糖。
　　 本研究對這兩個(gè)β-半乳糖苷酶的克隆表達(dá),使其產(chǎn)量比原菌株提高了5倍以上,通過純化研究,提供了工業(yè)純化可能的路線,為其工業(yè)應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。奶制品的生產(chǎn)離不開加熱消毒和低溫冷藏,如果在加熱消毒時(shí)加入L