1、目的： 1、分析2型糖尿病(T2DM)患者線粒體DNA(mtDNA)16SrRNA基因的變異情況，探討16SrRNA基因變異與T2DM及其慢性并發(fā)癥之間的關系。 2、探討16SrRNA基因突變是否與tRNALeu(UUR)A3243G突變同時對T2DM發(fā)生作用，為進一步功能學研究提供實驗數(shù)據(jù)。 方法： 1、隨機收集浙江地區(qū)人群中無血緣關系T2DM患者210例，均根據(jù)1997年WHO糖尿病診斷標準確診，并記

2、錄患者常規(guī)生化指標及基本臨床資料；隨機收集年齡、性別等與病例組相匹配的健康對照人群140例，無相關糖尿病及其并發(fā)癥病史，并排除糖尿病家族史、糖耐量異常、高血壓、高血脂、腦血管病變等。 2、提取全血基因組DNA，采用PCR擴增mtDNA16SrRNA基因片段，直接測序后與劍橋參考序列(revisedCambridgeReferenceSequence，rCRS)進行比對，分析其變異情況；利用Clustalx生物軟件分析堿基序列保守

3、性，并利用MFOLD:PredictionofRNAsecondarystructure(M.Zuker)軟件對16SrRNA二級結構進行預測，分析其自由能變化；結合統(tǒng)計學分析16SrRNA基因變異與糖尿病生化指標及慢性并發(fā)癥的相關性。 3、采用PCR-RFLP方法對存在mtDNA16SrRNA基因變異的標本進行線粒體tRNALeu(UUR)A3243G突變篩查，陽性標本進一步用變性高效液相色譜分析技術(DHPLC)及正反向測序

4、方法確認，并分析陽性標本的mtDNA全序列及臨床遺傳特點。 結果： 1、210例T2DM患者中共發(fā)現(xiàn)mtDNA16SrRNA基因41個變異，其中22個未報道，28個只出現(xiàn)在病例組；140例正常對照中共發(fā)現(xiàn)25個變異，其中11個未報道。所有變異在兩組間差異無顯著性。 2、從物種進化保守性角度發(fā)現(xiàn)mtDNA16SrRNA基因上7個變異位于人、牛、鼠、非洲爪蟾四個物種高度保守的區(qū)域：A1736G、A1811G、T185

5、0C、A1909G、A2195G、A2281G、A2833G。除A1736G同時出現(xiàn)在病例組和正常對照組中，其余變異均只出現(xiàn)在病例組中。 3、mtDNA16SrRNA基因A2706G變異在病例組和對照組所有標本中均出現(xiàn)，變異率為100％，可作為中國浙江人群線粒體基因的正常參考位點。 4、mtDNA16SrRNA基因二級結構預測發(fā)現(xiàn)：C1715T、T1850C、G1927A、A2581G、T2898C、G3010A、T30

6、83C、3173insC、A3209T等突變使自由能比野生型高，C1715T、3173insC、A3209T使其二級結構發(fā)生明顯變化，C1715T、T1850C、T2898C、T3083C只在病例組中出現(xiàn)且T1850C位于高度保守區(qū)域，推測這些突變與糖尿病存在一定的關系；C1734T、A1735G、A1736G、A1810G、A1811G、G1970A、A1927G、A2195G、A2246G、A2315G、C2389T、C2766T、

7、T3150C、A3190G、C3206T等變異使自由能比野生型低，使整個結構更穩(wěn)定，推測這些變異是在進化過程中產生的保護性改變。 5、含有16SrRNA基因變異的有家族史患者中女性發(fā)病率、HbAlc、FPG、LDL-C明顯比無家族史患者高，并發(fā)癥視網膜病變、周圍神經病變和腎病也更容易在有家族史組的患者中發(fā)生。 6、16SrRNA基因各變異在并發(fā)高血壓組和未并發(fā)高血壓組、并發(fā)視網膜病變組和未并發(fā)視網膜病變組、并發(fā)腎病組和未

8、并發(fā)腎病組、并發(fā)周圍神經病變組和未并發(fā)周圍神經病變組中無顯著統(tǒng)計學差異，但由于很多變異只在病例組中出現(xiàn)一次，不能排除其中某些位點與糖尿病慢性并發(fā)癥相關，需要擴大樣本量研究。 7、在84例含16SrRNA基因變異的標本中發(fā)現(xiàn)1例線粒體tRNALeu(UUR)A3243G突變陽性標本，其異質率16.30％。mtDNA全序列分析中共發(fā)現(xiàn)36個變異，大部分為基因多態(tài)性現(xiàn)象。提示線粒體tRNALeu(UUR)A3243G和16SrRNA基

9、因A2581G這兩個突變是該患者線粒體性糖尿病發(fā)病的主要遺傳因素。 8、線粒體tRNALeu(UUR)A3243G突變的糖尿病家系具有以下臨床特征：①呈母系遺傳方式；②遺傳早發(fā)現(xiàn)象；⑨胰島素依賴；④體重指數(shù)降低；⑤常伴耳聾。 結論： 1、mtDNA16SrRNA基因存在較多變異，大部分為基因多態(tài)性現(xiàn)象。但不能排除C1715T、A1811G、T1850C、A1909G、A2195G、A2281G、A2581G、A2