1、2型糖尿病是一種復雜的內分泌代謝疾病，其以胰島素抵抗為主，伴胰島素分泌不足引起的以持續(xù)性血糖升高為特征，臨床上表現(xiàn)三多一少，即多飲、多食、多尿和體重減少。隨著社會經濟的發(fā)展，生活水平的改變，糖尿病的發(fā)病率正逐年升高，其已成為繼惡性腫瘤，心腦血管疾病后的第三位嚴重危害人類健康的重大疾病。有效的對糖尿病進行防控是全人類面臨的重大難題。
　　 由于該病的發(fā)生發(fā)展與遺傳因素和環(huán)境因素均有密切關系，其發(fā)病機制目前尚未明確。因此，開展2型糖

2、尿病相關分子致病機制的研究對2型糖尿病尤其是其并發(fā)癥的早期預防、早期診斷、早期治療具有重大的指導意義。
　　 線粒體DNA突變及功能缺陷與2型糖尿病發(fā)病密切相關。線粒體的位點突變會導致線粒體結構、功能和基因表達的改變，與線粒體生物能量合成和能量代謝的缺陷密切相關;而線粒體單體群的不同提示在不同遺傳背景下，個體患2型糖尿病的風險不同，可能是2型糖尿病患病的分子基礎。雖然已有的研究發(fā)現(xiàn)線粒體DNA變異及單體群與2型糖尿病發(fā)病相關，相

3、關突變位點包括:A3243G，T16189C，C1310T等;相關單體群包括:N9a，D4，B4等。但目前，在不同單體群的遺傳背景下，線粒體基因變異與2型糖尿病發(fā)病相關研究還未見報道。
　　 因此，本研究以T2DM線粒體單體群及基因變異為切入點，通過建立浙江省漢族人群2型糖尿病及對照樣本標準化資源庫和數(shù)據(jù)庫，了解中國浙江溫州地區(qū)漢族人群2型糖尿病線粒體突變相關易感和保護基因及其常見突變方式，探討2型糖尿病易感的單體群及相關基因變

4、異的分子致病機制，并在此基礎上，聯(lián)合分析2型糖尿病線粒體單體群的不同遺傳背景和相關基因變異的相互作用，尤其是罕見變異和單次變異對T2DM的發(fā)病影響，為臨床上2型糖尿病及其并發(fā)癥的預警、診斷和治療提供科學的理論依據(jù)和技術指導。本研究主要分為以下兩部分內容:
　　 第一部分浙江省2型糖尿病與對照樣本的標準化資源庫建設
　　 此部分研究旨在建立覆蓋浙江省全省的2型糖尿病與對照樣本標準化資源庫，該標準化資源庫包含以下具體內容:①

5、受試者知情同意書;②受試者（及其家屬）基本資料表等;③受試者（及其家屬）入院資料、體格檢查結果、檢驗相關指標等臨床資料;④受試者（及其家屬）外周靜脈全血樣本;⑤受試者（及其家屬）全基因組DNA樣本;⑥受試者（及其家屬）基因檢測結果;⑦部分重點家系的永生細胞株。目前為止，該資源庫共納入2型糖尿病患者4586例，非糖尿病對照2247例。
　　 利用建立的2型糖尿病標準化資源庫，對現(xiàn)有2型糖尿病患者臨床發(fā)病情況、并發(fā)癥情況、遺傳方式以

6、及基因變異進行初步地分析。這些工作的完成不僅僅可以永久保存寶貴的糖尿病遺傳資源，為今后進一步深入開展科研及臨床工作奠定了良好的基礎。同時，也為2型糖尿病及并發(fā)癥的遺傳危險因素評估提供理論依據(jù)，尤其是為篩查出的線粒體糖尿病患者及其家屬提供遺傳咨詢、婚配指導和疾病預警的相關建議，實現(xiàn)2型糖尿病的早期診斷、干預和治療，有效降低T2DM的并發(fā)癥的發(fā)生。
　　 第二部分中國漢族人群線粒體單體群及基因變異與2型糖尿病的相關性研究
　　

7、 目的:
　　 研究浙江溫州地區(qū)漢族人群線粒體單體群、基因突變及其相互作用與2型糖尿病的關系
　　 方法:
　　 1.樣本收集納入:共納入溫州醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院內分泌科的漢族T2DM患者301例;非糖尿病對照組樣本403例來自溫州醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院體檢中心。詳細準確記錄各組樣本臨床基本情況及相關指標。
　　 2.基因擴增:通過提取受試者外周血基因組DNA，采用PCR技術擴增線粒體全基因組序列后，直接送公

8、司測序。
　　 3.序列比對分析:將測得的DNA序列與修正劍橋參考序列通過Condoncode Aligner軟件進行比對，查找變異位點;再對變異后氨基酸的改變進行分析;并應用PolyPhen2網(wǎng)站對氨基酸改變對蛋白質功能影響預測分析，同時應用Clustal X軟件分析氨基酸的保守性;另外，根據(jù)mtDNA變異位點，結合mtiomap網(wǎng)站和HaploGrep網(wǎng)站進行線粒體單體群分型。統(tǒng)計分析T2DM組與對照組中線粒體單體群的分布差

9、異，及不同單體群中不同類型mtDNA變異在T2DM和對照組中的分布差異。統(tǒng)計學分析均采用SPSS16.0軟件進行:計量資料采用t檢驗;計數(shù)資料采用x2檢驗和Fisher精確概率法檢驗。
　　 結果;
　　 1.本研究病例對照樣本中，2型糖尿病組在BMI、收縮壓、空腹血糖、低密度脂蛋白等指標水平均顯著高于非糖尿病對照組，經t檢驗P值均小于0.05，有顯著統(tǒng)計學差異。
　　 2.本研究納入人群單體群分布如下: D4(

10、13.90％)、D5(8.19％)、M7(8.93％)、M8a(1.74％)、M9(2.23％)、M10(1.99％)、M12(0.50％)、G(2.73％)、C(3.72％)、Z(3.72％)、N9a(3.47％)、A(6.70％)、R9(16.63％)、R11(1.74％)、B(20.35％)和Y(0.74％)等為我國相對多見的單體群。其中M8a(OR=3.032;95％CI,1.215-7.563; P=0.013)、Z(OR=0

11、.233;95％CI,0.066-0.820; P=0.014)和N9a(OR=2.388;95％CI,1.169-4.874; P=0.015)3種單體群在T2DM和對照組間的分布有統(tǒng)計學差異，提示M8a、Z和N9a這3種單體群可能與T2DM的發(fā)病風險密切相關。M8a和N9a患糖尿病的風險為其他單體群的3.032和2.388倍，為T2DM的易感人群;而Z患糖尿病的風險僅為其他單體群的0.233倍，降低了T2DM的患病風險。
　　

12、 3.線粒體基因組DNA經測序發(fā)現(xiàn)，在301例T2DM患者中，共檢測到1169種變異，其中點突變1135種，缺失11種，插入23種。403例對照樣本中，檢測到1397種變異位點，其中點突變1353種，缺失12種，插入32種。經x2檢驗，T2DM組中的線粒體基因缺失率顯著高于對照組，OR=1.255;95％CI,1.041-1.513; P=0.017，提示線粒體的基因缺失可能是T2DM的危險因素。
　　 4.將T2DM組和對照

13、組中所有的線粒體基因變異比較分析，x2檢驗發(fā)現(xiàn)，共有21個突變位點在2組中的分布具有顯著統(tǒng)計學差異，其中包括20個點突變和1個基因缺失。包括位于線粒體基因D-loop、ND5、ATP6、COⅠ、ND6、COⅢ、ND2等基因變異523delAC(OR=3.308;95％CI,2.268-4.826; P=0.000)、T16519C(OR=2.604;95％CI,1.939-3.498; P=0.000)、G12372A(OR=2.481

14、;95％CI,1.317-4.674; P=0.004)、C8684T(OR=3.176;95％CI,1.290-7.820;P=0.008)、G6179A(OR=3.176;95％CI,1.290-7.820; P=0.008)、G16473A(OR=5.474;95％CI,1.154-25.968; P=0.016)、C194T(OR=3.784;95％CI,1.193-12.001; P=0.016)、C16184T(OR=2.7

15、72;95％CI,1.170-6.565; P=0.016)、T14470C(OR=2.621;95％CI,1.152-5.963; P=0.017)、C12705T(OR=1.460;95％CI,1.070-1.991; P=0.017)、C9296T(OR=4.110;95％CI,1.103-15.312;P=0.023)、G5417A(OR=2.140;95％CI,1.097-4.176; P=0.023)、C8964T(OR=3

16、.428;95％CI,1.065-11.037; P=0.028)、G8020A(OR=2.554;95％CI,1.006-6.480; P=0.041)和A4833G(OR=2.206;95％CI,0.987-4.933; P=0.049)等15個基因變異可能增加了T2DM的發(fā)病風險;而基因D-loop、CYB、COⅠ、ATP6上的T16271C(P=0.006)、T15784C(OR=0.162;95％CI,0.037-0.709;

17、P=0.006)、C16185T(OR=0.258;95％CI,0.087-0.763;P=0.009)、A6752G(OR=0.229;95％CI,0.066-0.787; P=0.011)、T9090C(OR=0.280;95％CI,0.080-0.982; P=0.034)、C16291T(OR=0.389;95％CI,0.154-0.982; P=0.039)等6個變異則降低了T2DM的發(fā)病風險。上述位點僅有2個位點為錯義突變，

18、但保守性分析顯示該2個位點保守性差。
　　 5.在M單體群和N單體群中，線粒體上所有常見基因變異(MAF≥5％)在T2DM組和對照組中分布無差異，提示線粒體常見變異可能與T2DM的發(fā)病無關，僅為物種進化中的適應性SNP。
　　 6.在M單體群下，T2DM組線粒體基因CytB、ND1和ND3的低頻變異(1％≤MAF＜5％)少于對照組中的低頻變異;而在N單體群中，T2DM組則是線粒體基因tRNA的低頻變異少于對照組中的低頻變

19、異。
　　 7.在M單體群下，T2DM組線粒體基因D-loop、CytB、ND5和COⅡ的罕見變異(MAF＜1％)顯著高于對照組中的罕見變異，提示D-loop、CytB、ND5和COⅡ的罕見變異可能是2型糖尿病發(fā)病的危險因素;而N單體群下，T2DM組則是線粒體基因COⅡ和ND1的罕見變異顯著高于對照組中，提示COⅡ和ND1的罕見變異可能是2型糖尿病發(fā)病的危險因素。
　　 8.對比分析單體群M和N中單次變異（在所有樣本中僅

20、出現(xiàn)一次）的分布情況，各基因在M和N中的累計變異基本分布一致。但COⅢ的單次突變給N單體群人群增加了T2DM的患病風險，而非M單體群T2DM的危險因素;而CytB和COⅡ的單次變異與M單體群人群T2DM發(fā)病相關;ND4的單次變異則與N單體群人群T2DM發(fā)病相關。
　　 9.統(tǒng)計罕見變異中的錯義突變，T2DM組和對照組間無差異。分別針對各個編碼基因進行分析，基因CytB（OR=2.225;95％CI，1.443-3.489; P=

21、0.000）、ND5(OR=1.925;95％CI,1.122-3.303; P=0.016)和ATP6(OR=1.813;95％CI,1.041-3.159; P=0.034)中罕見錯義突變在T2DM組顯著高于對照組，可能增加了T2DM的患病風險;且發(fā)現(xiàn)ND1的L181M（2例）、ND4的N138S（2例）、ATP6的G16S（4例）和A177T（2例）這4種具有破壞效應的突變僅在T2DM組出現(xiàn)，且ATP6的G16有保守性好。