1、脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是骨科領(lǐng)域致殘率、死亡率最高的創(chuàng)傷之一，是交通、工礦事故及運動意外中常見的損傷。近年來，神經(jīng)干細胞(neural stem eell，NSC)移植成為SCI截癱治療的研究焦點之一。但最近國外有研究表明，將體外懸浮方式培養(yǎng)的大鼠胚胎NSC移植入成鼠損傷脊髓后，移植細胞只能分化成星形膠質(zhì)細胞；并認為這是由于宿主損傷脊髓內(nèi)環(huán)境不支持NSC向神經(jīng)元祖細胞分化所致，但損傷脊髓卻允許譜系限制性

2、的神經(jīng)元前體細胞(neuronal-restricted precursor cell，NRP)和膠質(zhì)前體細胞(glial-restricted precursor cell，GRP)的存活及分化。貼壁方式培養(yǎng)的神經(jīng)前體細胞主要由NRP/GRP組成，于是貼壁培養(yǎng)手段重新受到國外一些學者的重視。然而，究竟何種類型細胞更適于SCI移植治療，目前尚無定論。本實驗比較了神經(jīng)前體細胞在懸浮與貼壁兩種培養(yǎng)方式下的生長特性，旨在為選擇合適類型的細胞移

3、植治療SCI提供參考依據(jù)。 SCI包括原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷。原發(fā)性損傷為不可逆性改變，故治療主要針對繼發(fā)性損傷。研究已發(fā)現(xiàn)由氧自由基介導的脂質(zhì)過氧化反應對脊髓繼發(fā)性損傷起主要作用。脂質(zhì)過氧化損傷的程度對移植細胞的命運影響也很大。祖國醫(yī)學將SCI所致的截癱，歸屬于體惰和痿證的范疇，治療上以活血化瘀、疏通督脈、通經(jīng)活絡(luò)、益氣補血、補腎填精為主。腎主骨生精髓，精髓傷則腎傷，精血互生，且腎所生精髓需靠后天之本、氣血化生之源的脾胃源源不

4、斷地充盈。滋補脾陰方藥(nourishing piyin remedy)具有益氣補血、補腎填精、充盈脾胃等功效，可以改善脊髓細胞線粒體ATP酶活性，緩解脂質(zhì)過氧化反應：并能通過調(diào)節(jié)磷脂代謝，增強線粒體膜抗氧化能力以保護腦神經(jīng)細胞。本實驗探討了滋補脾陰方藥含藥血清對NRP/GRP細胞脂質(zhì)過氧化損傷的保護作用及機制，旨在為進一步聯(lián)合應用含藥血清和NRP/GRP細胞移植治療SCI奠定基礎(chǔ)。目前在SCI模型建立方面，國內(nèi)外以Allen裝置或NY

5、U裝置打擊的輕度挫傷模型(致傷力2.5g×10cm)應用較為廣泛。中度挫傷模型(致傷力5g×10cm)涉及很少。輕度脊髓挫傷后，早期的組織缺失及后期的繼發(fā)損傷均較輕。而中度挫傷在形態(tài)學及病理生理學上的損傷均較重，移植物的生存環(huán)境更差，其中過氧化損傷作用尤為明顯。因此，本實驗利用滋補脾陰方藥含藥血清的抗過氧化損傷作用，預先保護移植NRP/GRP細胞，以探討二者聯(lián)合應用對脊髓中度挫傷的神經(jīng)修復作用。 實驗一胚胎脊髓源神經(jīng)前體細胞懸浮

6、與貼壁培養(yǎng)的生長特性研究目的：比較胚胎脊髓源神經(jīng)前體細胞在懸浮與貼壁兩種培養(yǎng)方式下韻生長特性，為選擇合適類型的細胞移植治療脊髓損傷提供參考依據(jù)。 方法：取孕13.5天的SD大鼠胚胎脊髓組織，按懸浮和貼壁兩種方式分組培養(yǎng)神經(jīng)前體細胞。觀察細胞生長形態(tài)學變化。描繪細胞生長曲線。培養(yǎng)72小時后行BrdU增殖率檢測，Nestin、PSA-NCAM、A<,2>B<,5>抗體熒光鑒定和流式細胞檢測。部分細胞行胎牛血清誘導分化試驗。

7、結(jié)果：懸浮組細胞多以細胞球形態(tài)生長，貼壁組細胞呈散在生長。懸浮組細胞生長狀態(tài)更旺盛。培養(yǎng)72小時懸浮和貼壁組細胞的Brdu增殖率分別為28.50﹪±4.67﹪和9.11﹪±1.82﹪(P<0.05)；兩組細胞Nestin、NCAM、A<,2>B<,5>抗體熒光反應均呈陽性：懸浮組各抗體表達率相對較均勻，而貼壁組以NCAM、A<,2>B<,5>抗體表達為主(>80﹪)。兩組細胞經(jīng)胎牛血清誘導，均能逐漸分化成熟，表達NF-200，GFAP，

8、Gal-C熒光抗體。 結(jié)論：懸浮組細胞增殖能力強于貼壁組。早期懸浮培養(yǎng)細胞以神經(jīng)干細胞和祖細胞為主；而貼壁培養(yǎng)細胞則以譜系限制性神經(jīng)前體細胞為主(>80﹪)。懸浮及貼壁組細胞經(jīng)胎牛血清誘導，均可分化成為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞。目的：探討滋補脾陰方藥含藥血清對譜系限制性神經(jīng)前體細胞脂質(zhì)過氧化損傷的保護作用，為進一步體內(nèi)移植實驗治療脊髓損傷奠定基礎(chǔ)。 方法：取貼壁培養(yǎng)3天的譜系限制性神經(jīng)前體細胞，分正常組、損傷

9、組、空白血清干預組、中藥血清干預組、空白血清干預后損傷組和中藥血清干預后損傷組，建立過氧化氫損傷模型。觀察細胞形態(tài)學變化：利用MTT法計算細胞存活率；檢測細胞內(nèi)MDA含量和SOD活力；并行Hoechst33258熒光染色，觀察細胞熒光分布和凋亡情況。 結(jié)果：過氧化氫損傷可造成細胞存活率顯著降低：細胞內(nèi)MDA含量明顯增加，SOD活力明顯下降；并加快細胞凋亡。經(jīng)含藥血清干預后的細胞在同樣損傷條件下，細胞存活率提高；并避免了細胞內(nèi)MD

10、A含量的過度增加，和SOD活力的過度下降；還能減輕細胞凋亡。 結(jié)論：滋補脾陰方藥含藥血清對譜系限制性神經(jīng)前體細胞脂質(zhì)過氧化損傷起一定程度的保護作用；并能改善過氧化損傷后細胞的存活率和存活狀態(tài)。目的：探討譜系限制性神經(jīng)前體細胞(NRP/GRP)移植對脊髓中度挫傷的神經(jīng)修復作用，及滋補脾陰方藥含藥血清對移植細胞在體內(nèi)存活、遷移和分化的影響。 方法：成年雌性SD大鼠60只，隨機分為假手術(shù)組(A組)、損傷對照組(B組)、DME

11、M培養(yǎng)基移植組(C組)、NRP/GRP移植組(D組)、NRP/GRP與空白血清共移植組(E組)，和NRP/GRP與中藥血清共移植組(F組)。利用自制電控打擊器制作動物模型。通過BBB評分、皮層體感誘發(fā)電位測定，評價運動、感覺功能恢復情況。術(shù)后4天、2周和5周時，分別觀察BrdU標記的移植細胞在體內(nèi)的存活、遷移和分化情況。 結(jié)果：F組在術(shù)后2周，BBB評分明顯恢復。D組、E組在術(shù)后4周，BBB評分明顯恢復。術(shù)后5周F組CSEP波形

12、略恢復。術(shù)后4天、2周和5周時，細胞移植三組分別可見較多的BrdU標記細胞在體內(nèi)存活、遷移和分化，均以F組最明顯。結(jié)論：譜系限制性神經(jīng)前體細胞移植后，可以在體內(nèi)存活、遷移并分化成熟，促進大鼠脊髓中度挫傷后神經(jīng)纖維的修復與再生。滋補脾陰方藥含藥血清可以改善損傷脊髓內(nèi)環(huán)境，有利于移植細胞的存活、遷移及分化。二者聯(lián)合應用具有協(xié)同效應。 本實驗通過對滋補脾陰方藥保護譜系限制性神經(jīng)前體細胞移植治療大鼠脊髓損傷的研究，獲得了以下成果： 1

13、．早期懸浮培養(yǎng)細胞是以神經(jīng)干細胞和神經(jīng)祖細胞為主的混合物；而貼壁培養(yǎng)細胞則以譜系限制性神經(jīng)前體細胞為主(>80﹪)。懸浮及貼壁培養(yǎng)細胞經(jīng)胎牛血清誘導，均可分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞。 2．滋補脾陰方藥含藥血清通過避免細胞過氧化損傷后SOD過度下降，減少損傷后MDA生成，對譜系限制性神經(jīng)前體細胞脂質(zhì)過氧化損傷起一定程度的保護作用。 3．譜系限制性神經(jīng)前體細胞在脊髓中度挫傷后即刻移植，可以在體內(nèi)存活、遷移并分化

14、為成熟的神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞及少突膠質(zhì)細胞，從而促進大鼠脊髓損傷后神經(jīng)纖維的修復與再生；是治療脊髓損傷較有前景的細胞移植物。 4．滋補脾陰方藥含藥血清可以改善損傷脊髓的內(nèi)環(huán)境，減輕移植細胞的過氧化損傷反應，有利于移植譜系限制性神經(jīng)前體細胞在體內(nèi)的存活、遷移和分化。滋補脾陰方藥含藥血清與譜系限制性神經(jīng)前體細胞移植聯(lián)合應用治療脊髓損傷，具有協(xié)同效應。 5．如何進一步增強譜系限制性神經(jīng)前體細胞的增殖能力，增強滋補脾陰方藥含藥血