1、嚴重創(chuàng)傷、休克、膿毒癥病人在經歷缺血缺氧、再灌注損傷以及腸道菌群移位、內毒素釋放等的“多重打擊”后，常常在失代償期出現(xiàn)不可逆的組織細胞損傷，出現(xiàn)全身炎癥反應綜合癥(SIRS)、急性呼吸窘迫綜合癥(ARDS)乃至多器官功能衰竭(MOF)。究其原因，除了全身炎癥失控外，休克后血管反應性降低是另一重要原因。血管低反應性表現(xiàn)為全身血管對縮血管物質和舒血管物質的反應降低或反應麻痹，導致血壓不能有效提升、組織灌注難以改善，細胞缺氧和損傷進行性加重。

2、因此，血管低反應性的發(fā)生一方面影響休克的發(fā)生和發(fā)展，另一方面嚴重地影響著創(chuàng)傷/休克的治療和轉歸。研究發(fā)現(xiàn)血管低反應性的發(fā)生與腎上腺素能受體失敏、血管平滑肌細胞(VSMc)鉀、鈣通道功能失常及細胞膜超極化有關。此外，本實驗室前期研究也發(fā)現(xiàn)Rho激酶可通過調節(jié)肌球蛋白輕鏈磷酸酶(MLCP)的活性和肌球蛋白輕鏈(MLC20)磷酸化水平及鈣敏感性變化參與休克后血管反應性的調節(jié)。 HIF-1α通過調節(jié)多種基因的表達來調節(jié)細胞對低氧的適應性

3、反應，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一的一個在缺氧狀態(tài)下發(fā)揮特異性活性的調節(jié)分子，被認為是調節(jié)缺氧相關基因表達的關鍵分子，它同激活蛋白(activated protein 1，AP-1)，核轉錄因子(nuclear factorkB，NF-kB)和p53等協(xié)同作用調節(jié)機體對缺氧的反應，其功能涉及能量代謝、細胞增殖、造血作用、血管形成、重塑與收縮等諸多方面。 缺血缺氧是各種類型休克的最基本的病理生理變化，故HIF-1α應該是休克后表達和活性變

4、化最顯著的分子之一。大量研究表明：失血性休克后期可激發(fā)明顯的失控性系統(tǒng)炎癥和缺血再灌注損傷，HIF-1α通過多種途徑參與了上述兩種損傷效應的形成和發(fā)展。而有關HIF-1α與血管舒縮活性及反應性的相關研究目前鮮有文獻報道。由此，本實驗選擇缺氧誘導因子1 α(HIF-1α及其一系列下游分子作為研究靶點，以HIF-1 α特異性阻斷劑寡霉素為工具藥，探討HIF-1 α對休克血管反應性的調控作用。具體內容包括兩大部分：(1)HIF-1α在失血性休

5、克后血管反應性變化中的調節(jié)作用；(2)失血性休克后HIF-1α調節(jié)血管反應性的機制。 主要實驗方法： 第一部分觀察HIF-1α在失血性休克后血管反應性變化中的調節(jié)作用，包括：建立大鼠重癥失血性休克模型，制備腸系膜上動脈(SMA)血管環(huán)，利用離體血管環(huán)張力測定技術，觀察休克后不同時相點(休克0.5h，休克1.0h，休克2.0h，休克3.0h，休克4.0h，休克6.0h)SMA對梯度濃度去甲腎上腺素(NE)的收縮反應性。同時

6、取腸系膜動脈，利用RT-PCR技術分析測定休克后各時相點HIF-1α mRNA表達變化。同時利用以HIF-1α特異性阻斷劑寡霉素為工具藥，觀察給藥后休克各時相點血管環(huán)張力和HIF-1αmRNA表達變化，進而分析HIF-1α基因轉錄水平對休克血管反應性的影響。 第二部分，通過在體和離體實驗，探討失血性休克后HIF-1α調節(jié)血管反應性的機制。在體實驗：取大鼠失血性休克SMA組織，RT-PCR觀察休克后eNOS、iNOS、HO-1、C

7、OX-2mRNA時相表達變化，同時分別采用連二亞硫酸鈉(Na<,2>S<,2>O<,4>)還原法、硝酸還原酶法和放射免疫技術(RIA)測定休克后各時相血NO、CO、PGI含量變化，進而分析失血性休克后HIF-1α對eNOS/iNOS-NO、HO-1-CO和COX-2-PGI通路的影響。離體實驗：利用Transwell培養(yǎng)小室缺氧共培養(yǎng)血管平滑肌細胞(VsMC)和內皮細胞(VEC)，測定Teanswell下腔熒光滲透率反映VSMC對去甲腎

8、上腺素(NE)的收縮反應性；同時利用RT-PCR半定量分析HIF-1α及其相關分子的mRNA表達變化規(guī)律：內皮型一氧化氮合酶(eNOS)、誘生型一氧化氮合酶(iNOS)、環(huán)氧合酶-2(COX-2)、血紅素氧合酶-1(HO-1)，進一步分析缺氧后VSMC收縮反應的影響與上述分子的影響的關系。 主要研究結果： 1．失血性休克后HIF-1α mRNA表達逐漸增強，并于4h出現(xiàn)表達峰值(P<0.01)。血管反應性呈現(xiàn)雙相變化，即

9、早期(0.0h-1.0h)血管反應性增高，量一效曲線左移、最大收縮力(Emax)顯著性增大和pD<,2>減小(P<0.01)。至休克中、后期，血管反應性進行性下降，表現(xiàn)為量一效曲線右移、Emax降低和pD2增大，至休克后4h血管反應性即低于正常水平(P<0.01)。休克后給藥組血管反應性亦呈現(xiàn)雙相變化，但其幅度明顯降低。表現(xiàn)為在早期(0.5-1.0h)血管反應性的抬高趨勢被部分抑制(P<0.01)，至休克晚期(4.0-6.0h)可使血管

10、反應性得以輕度回升(P<0.05或P<0.01)。 2．失血性休克后eNOS、iNOS、HO-1、COX-2 mRNA表達均隨時相的延長而逐漸增強，分別于1.0h、2.0h、3.0h和4.0h到達高峰(P<0.05或P<0.01)。給藥組eNOS、HO-1、COX-2：mRNA表達量基本波動于正常范圍。而iNoS則表現(xiàn)為休克早、中期(1.0h-3.0h)表達受抑制，而在晚期(4.0h-6.0h)較休克同時相有顯著增加(P<0.0

11、1)。 3．血漿NO、PGI和全血CO濃度均隨著休克時相進展而顯著升高(P<0.05或P<0.01)。HIF-1α特異性阻斷劑寡霉素可使CO則穩(wěn)定于正常水平，而NO和PGI表達被部分抑制，隨著休克時相的延長有增高趨勢，但其幅度顯著低于休克同時相組(P<0.011。 4．缺氧后VSMC收縮反應性呈現(xiàn)雙相變化，即缺氧早期(0.0-1.0h)VSMC收縮反應性顯著性增高且于0.5h達到峰值(P<0.01)。至缺氧后期(4.0-

12、6.0h)VSMC收縮反應性進行性下降，至4h血管反應性即低于正常水平，至6h僅為正常對照的70％(P<0.05)。給藥組則表現(xiàn)為缺氧后早期反應性的增高趨勢被完全抑制(P<0.05或P<0.01)，而4.0h-6.0h VSMC的收縮反應性可有部分提高(P<0.05)。 5．vSMC+vEC混合培養(yǎng)后，隨著缺氧時相的延長，HIF-1α、iNOS、HO-1、COX-2mRNA表達均逐漸增強，分別于4.0h、2.0h、3.0h和4.

13、0h到達高峰(P<0.01或P<0.05)。給藥組各時相表現(xiàn)為上述mRNA表達增強趨勢被完全抑制，基本均波動于正常范圍內。eNOS mRNA表達受缺氧和給藥處理方式的影響輕微，缺氧組和給藥組各時相表達量與正常對照擁比均無顯著變化。 結論： 1．失血性休克后大鼠SMA收縮反應呈雙相變化，即休克早期血管反應性增高，晚期血管反應性降低。HIF-1αmRNA表達隨休克時相進展逐漸上調，至晚期進行性下降。HIF-1α阻斷劑寡霉素處

14、理可對休克后血管反應性的雙相變化產生雙相調節(jié)作用：在早期0.5-1h可部分抑制血管反應性的抬高趨勢，至休克晚期可使血管反應性得以輕度回升。HIF-1α在失血性休克大鼠血管收縮反應性的雙相變化的形成中發(fā)揮了重要的調節(jié)作用：其轉錄水平在休克早期的輕度上調與血管收縮反應性呈正相關，至休克晚期則呈負相關。 2．休克后eNOS、iNOS、HO-1和COX-2 mRNA表達依次激活、上調并達峰值，在阻斷HIF-1α表達后其轉錄水平亦不同程度

15、地受到明顯抑制。HIF-1 α調節(jié)血管反應性的途徑包括eNOS/iNOS-NO、HO-1-CO、COX-2-PGI等通路，通過影響具有血管舒縮功能調節(jié)作用分子的基因表達，從而引起血管舒縮活性物質的生成和釋放的相應變化：HS早期HIF-1α及其下游分子代償性增加，其輕度表達有利于血管反應性的適應性保護，為正相關因素。至休克失代償期轉化為負相關：即HIF-1α過度激活、表達并蓄積，引起NO、CO、PGI等血管活性物質的產生失調、釋放失控和作