1、目的：Salusin-β是一種新發(fā)現(xiàn)的心血管調節(jié)肽，其心血管效應遠未闡明。本研究的目的是探明salusin-β是否具有抗心肌缺血再灌損傷作用及其機制。 一、實驗模型和方法 1.離體心臟缺血再灌損傷模型 離體大鼠心臟懸掛于Langendorff系統(tǒng)后以95％O2+5％CO2飽和的KH液進行逆行恒壓(80cmH2O)灌流。將前端帶有球囊的導管經左心房插入左心室，通過調節(jié)球囊的體積將左室舒張末壓調至6mmHg。經過2

2、5min的平衡灌流后，全心停灌45min后復灌30min。salusin-β預處理組于停灌前5min給予10-10mol/L、10-9mol/L、10-8mol/Lsalusin-β。 2.心肌細胞缺氧復氧模型 以fluo-3/AM負載的大鼠心室肌細胞用100％O2飽和的臺氏液液灌流15min后，用1mmol/LNa2S2O4引起化學缺氧的無糖臺氏液灌流15min作為缺氧，然后轉換成氧合(100％O2)臺氏液灌流10mi

3、n，作為復氧過程。10-8mol/Lsalusin-β在缺氧復氧前5min開始灌流。 3.無鈉外液灌流引起的鈣超載模型 用酶解法分離大鼠心室肌細胞，以fluo-3/AM為鈣指示劑，對照組心肌細胞臺氏液灌流15min后換以無鈉臺氏液灌流10min，10-8mol/Lsalusin-β在無鈉臺氏液灌流前5min開始灌流。 4.心肌細胞全細胞電流記錄 將酶解法分離得到的細胞懸液加入細胞池內，并以1ml/min的

4、速度用細胞外液灌流。玻璃微電極由自動拉制儀(P-97)制備，用電極內液充灌，電極電阻通常為2-4MO，形成高阻封接前補償液結電位，補償快電容后再用較大負壓吸破細胞膜，補償電容電流和電極串聯(lián)電阻，形成全細胞記錄模式。串聯(lián)電阻補償70-90％。在電流鉗模式下記錄動作電位，在電壓鉗模式下記錄各種電流。所有實驗均在室溫(20-23℃)進行，信號經Ag/AgCl電極引導，由膜片鉗放大器(EPC10，德國)放大，計算機通過軟件(Pulse/Puls

5、efit)經模/數轉換系統(tǒng)采集數據，用Igor程序進行數據分析。 二、主要結果 (一)Salusin-β對離體大鼠心臟缺血再灌后心功能的影響 在缺血停灌前期間，各阻心率、冠脈流量以及各項心功能觀察指標基本保持恒定，各組間各指標無顯著差別。心率、冠脈流量復灌時顯著低于停灌前，后逐步恢復，各組心率無顯著差別。 (二)Salusin-β對缺氧復氧和無鈉外液灌流引起的心肌細胞鈣超載的影響 1.對照組心肌細

6、胞胞內鈣離子濃度(以相對值表示，缺氧前為1)缺氧后10min內逐步上升，10min時為1.36±0.14，缺氧后期胞內鈣離子濃度迅速上升，15min時為1.69±0.17，復氧后胞內鈣離子濃度進一步上升，復氧后2min為1.79±0.22，復氧后期胞內鈣離子濃度保持相對穩(wěn)定。 10-8mol/Lsalusin-β組心肌細胞在缺氧復氧期間胞內鈣離子濃度上升的速度要慢于對照組，缺氧10min、15min胞內鈣離子濃度分別為1.10±

7、0.18(p＜0.01vscontrol)和1.34±0.28(p＜0.01vscontrol)，復氧2min時為1.51±0.25(p＜0.01vscontrol)，均顯著低于對照組。以上結果表明salusin-β可以減輕缺氧復氧引起的心肌細胞鈣超載。 2.對照組和salusin-β組心肌細胞內鈣離子濃度在臺氏液灌流期間無明顯差別，而用無鈉臺氏液灌流后，對照組心肌細胞胞內鈣離子濃度迅速上升，10min時為1.49±0.13，而

8、10-8mol/Lsalusin-β組心肌細胞胞內鈣離子濃度無鈉外液灌流10min時為1.26±0.06，顯著低于對照組(p＜0.01)。以上結果表明salusin-β可以減輕無鈉外液灌流引起的心肌細胞鈣超載。 (三)Salusin-β對心肌細胞對動作電位(AP)、L型鈣通道電流(ICa,L)、鈉鈣交換電流(INaCa)、鈉電流(INa)、ATP敏感鉀通道電流(IKATP)、瞬時外向鉀電流(Ito)、持久激活鉀電流(Isus)、

9、內向整流鉀電流(IK1)等電流的影響 1.在全細胞電流鉗模式下記錄大鼠心室肌細胞AP，10-10-10-7mol/Lsalusin-β對靜息電位、動作電位幅度無明顯影響。10-8mol/L和10-7mol/Lsalusin-β可以明顯縮短APD50和APD90。對照APD50為43.70±6.23ms，給予10-8mol/L和10-7mol/Lsalusin-β后分別為34.55±2.88ms(p＜0.05vscontrol)和

10、29.65±3.40ms(p＜0.01vscontrol)。對照APD90為82.29±14.55ms，給予10-8mol/L和10-7mol/Lsalusin-β后分別為60.92±4.68ms(p＜0.05vscontrol)和51.25±8.20ms(p＜0.01vscontrol)。沖洗后部分逆轉salusin-β縮短APD的作用。 2.在斜坡刺激中以對Ni2+敏感部分的電流作為INaCa。Salusin-β對內向、外向

11、INaCa均有抑制作用，10-8mol/Lsalusin-β使心室肌內向INaCa(-100mV)從-3.94±0.66pA/pF降為-2.47±0.41pA/pF(p＜0.05)，使外向INaCa(+50mV)從2.93±0.42pA/pF降為2.02±0.35pA/pF(p＜0.05)。 3、Salusin-β呈濃度依賴性抑制大鼠心肌細胞ICa,L，10-10-10-7mol/Lsalusin-β灌流5min后ICa，L分別

12、下降6±4％、10±6％、22±6％、30±9％，后兩者顯著高于對照組的5±3％(p＜0.01，n=8)。10-8mol/Lsalusin-β灌流5min后Ⅳ曲線明顯上移，但不改變ICa，L的電壓依賴關系和反轉電位。對照ICa,L激活曲線的半激活電位是-18.23±1.41mV，斜率是4.70±0.18mV，10-8mol/Lsalusin-β灌流后半激活電位是-18.84±1.55mV，斜率是4.83±0.21mV。對照ICa,L失活

13、曲線半失活電位是-26.44±1.28mV，斜率是4.12±0.15mV。10-8mol/Lsalusin-β灌流后半失活電位是-26.99±1.36mV，斜率是4.05±0.17mV。上述結果表明salusin-β不改變L型鈣通道激活和失活的門控特點。 4.在由50mV到-100mV持續(xù)125ms的斜坡刺激下記錄心肌細胞KATP通道電流。10-8mol/Lsalusin-β不能使該電流增加，給予pinacidil后該電流明顯增

14、加，并且能被glibenclamide阻斷(說明該電流是IKATP)。10-8mol/Lsalusin-β也不能抑制IKATP，在0mV時pinacidil使IKATP增加為6.41±1.90pA/pF，再給予salusin-βIKTP為6.24±1.86pA/pF，兩者無統(tǒng)計學差別(p＞0.05，n=8)，提示salusin-β即不能使靜息狀態(tài)下的KATP通道開放，也不能使已經開放的KTP通道關閉。 5.Salusin-β使I

15、toⅠ-Ⅴ曲線上移，10-8mol/Lsalusin-β灌流后5min后去極化全30mV、40mV、50mV、60mV時的Ito電流密度值分別為7.84±1.10pA/pF、9.41±1.22pA/pF、11.30±1.49pA/pF和13.11±1.74pA/pF，均顯著高于對照組的6.51±0.89pA/pF、7.82±0.98pA/pF、9.40±1.04pA/pF和10.87±1.26pA/pF(p＞0.05，n=6)，沖洗后基

16、本恢復。Isus在給予salusin-β后未發(fā)生明顯改變。 6.Salusin-β對IMa峰值、到達峰值時間、Ⅳ曲線、反轉電位無明顯影響。 7.心肌細胞超級化至-120mV時的IK1為21.95±4.17pA/pF，10-8mol/Lsalusin-β灌流后10minIK1為21.93±4.10pA/pF，兩者無統(tǒng)計學差別(P＞0.05，n=6)。Salusin-β不改變IK1的Ⅰ-Ⅴ曲線形態(tài)，也沒有使其向左右移動或上下

17、移動 三、結論 本工作在離體灌流大鼠心臟缺血再灌損傷模型中，觀察到salusin-β能夠顯著改善復灌后心功能指標；在缺氧復氧和無鈉外液灌流引起的心肌細胞鈣超載模型中，觀察到salusin-β可以顯著減輕心肌細胞鈣超載；在研究salusin-β對心肌細胞動作電位、通道電流的影響中，觀察到salusin-β能夠顯著縮短動作電位時程，抑制鈉鈣交換電流和L型鈣通道電流，增加順時外向鉀電流，而對ATP敏感鉀通道電流、內向整流鉀電流