1、目的：觀察腎上腺髓質(zhì)素(Adrenomedullin，ADM)對幼年大鼠心肌細胞(cardiacmyocyte)凋亡的影響，并探討其可能的作用受體及其信號轉(zhuǎn)導途徑。 方法：1.細胞分離培養(yǎng)與鑒定：用酶消化法分離細胞，差速貼壁法和藥物抑制成纖維樣細胞純化獲得心室肌細胞為材料，用光學顯微鏡和免疫細胞化學的方法鑒定細胞。2.檢測方法：MTT比色法測定細胞活度，雙苯并咪唑(Hoechst33342)染料熒光顯微鏡檢測和DNA末端標記法(

2、TUNEL)檢測細胞凋亡率，免疫細胞化學方法檢測細胞內(nèi)蛋白激酶B(Akt)的表達。3.實驗分組：根據(jù)不同的藥物及藥物不同濃度，實驗共分五部分，第一部分：觀察ADM對基礎(chǔ)狀態(tài)下的心肌細胞是否有影響。共分5組：不同濃度(10-10～10-7M)的ADM組和空白對照組。第二部分：觀察血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是否能夠誘導心肌細胞凋亡，并確定合適的誘導細胞凋亡模型的實驗濃度。共分5組：不同濃度的(10-9～10-6M)AngⅡ組和空白對照組。第三

3、部分：觀察ADM對AngⅡ誘導心肌細胞凋亡的影響。共分6組：空白對照組，AngⅡ(10-7M)誘導凋亡對照組，不同濃度的ADM(10-10～10-7M)+AngⅡ(10-7M)組。第四部分：ADM在心肌細胞上作用的受體觀察ADM對心肌細胞凋亡的影響：分別以CGRP受體拮抗劑(CGRP8-37)和ADM特異性受體拮抗劑(ADM22-52)進行干預研究，共分6組：空白對照組，AngⅡ?qū)φ战M，AngⅡ+ADM對照組，AngⅡ+ADM+CGRP

4、8-37組，AngⅡ+ADM+ADM22-52組，AngⅡ+ADM+CGRP8-37+ADM22-52組。第五部分：ADM在心肌細胞受體后信號轉(zhuǎn)導途徑的研究：①采用cAMP抑制劑(Br-cAMP)進行干預研究，共分4組：空白對照組，AngⅡ?qū)φ战M，AngⅡ+ADM對照組，Br-cAMP+AngⅡ+ADM組；②對于Akt/PKB途徑研究分3組：設(shè)置空白對照組，AngⅡ?qū)φ战M，AngⅡ+ADM對照組，用特異性Akt單克隆抗體對此3組進行免疫

5、細胞化學法檢測。4.數(shù)據(jù)處理：用SPSS12.0軟件包；細胞活度A值數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(-x±s)表示，單因素方差分析進行統(tǒng)計學處理，兩兩比較采用LSD法，P＜0.05為有統(tǒng)計學意義；細胞凋亡率數(shù)據(jù)處理，采用卡方檢驗，兩兩比較采用標準四格表法，檢驗水準為P＜0.05有統(tǒng)計學意義。 結(jié)果：1.培養(yǎng)的細胞經(jīng)過光學顯微鏡和免疫細胞化學的方法鑒定為心肌細胞，純度達95％以上。 2.ADM在基礎(chǔ)狀態(tài)下對心肌細胞凋亡無明顯影響，AD

6、M各濃度組(10-10～10-7M)與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。 3.ADM呈濃度依賴性地抑制AngⅡ的誘導心肌細胞凋亡作用。ADM+AngⅡ各濃度組(10-10～10-7)A值明顯高于AngⅡ組(P＜0.05)，細胞凋亡率隨濃度的增加而降低，各濃度組之間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。10-7M濃度的ADM抑制AngⅡ誘導心肌細胞凋亡的作用最為顯著，與空白對照組比較無顯著差異(P＞0.05)。

7、 4.ADM在心肌細胞上作用受體的研究：在AngⅡ誘導心肌細胞凋亡的情況下，CGRP8-37和ADM22-52能顯著拮抗ADM對AngⅡ誘導心肌細胞凋亡的抑制作用，與AngⅡ+ADM對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，二拮抗劑單獨作用均不能完全拮抗ADM作用，與AngⅡ組比較差異顯著(P＜0.05)，二者合用也不可完全拮抗ADM作用，與AngⅡ組比較差異顯著(P＜0.05)。 5.ADM在心肌細胞受體后信號轉(zhuǎn)導途徑的

8、研究顯示：cAMP抑制劑Br-cAMP能阻斷ADM對AngⅡ誘導心肌細胞凋亡的抑制作用，與AngⅡ+ADM對照組比較有顯著差異(P＜0.01)，與AngⅡ組比較仍有顯著差異(P＜0.01)。Akt免疫細胞化學，AngⅡ+ADM組可見少量細胞陽性，說明受體后的Akt/PKB途徑在一定意義上可能參與了ADM對心肌細胞凋亡的保護作用。 結(jié)論：1.ADM對基礎(chǔ)狀態(tài)下的心肌細胞無影響； 2.ADM呈濃度依賴性地抑制AngⅡ介導的心