1、目的：觀察人腎上腺髓質素(Adrenomedullin，ADM)對體外培養(yǎng)的活化正常大鼠肝星狀細胞(HSC-T6)增殖及其細胞周期相關蛋白表達的影響，初步探討ADM對肝星狀細胞增殖的作用及機制，以期為臨床預防和治療肝纖維化提供理論依據。 方法：大鼠肝星狀細胞系(HSC-T6，其表型為活化的HSC)以10％胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基、37℃、5％CO2常規(guī)培養(yǎng)。預先將ADM0.1mg(合1.6586×10-8mol)溶于10

2、ml培養(yǎng)基(合1.6586×10-4mol/L)，備用。 1.MTT檢測HSC-T6增殖：取生長良好的HSC-T6，經0.25％胰酶消化，用培養(yǎng)基制備細胞懸液，種于96孔板中，每組設6個復孔。接種在96孔板中的細胞待24h后細胞貼壁，換用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基同步化處理24h后，加入ADM作用，根據作用時間不同分組如下：Ⅰ組(12h組)；Ⅱ(24h組)；Ⅲ(48h組)；Ⅳ組(Oh組即Oh對照組)。各組又根據加入ADM量不

3、同分組如下：A、B、C、D組，分別加入200 μL含100 mL/L胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液的細胞懸液(ADM為0，即ADM對照組)；加入ADM液及細胞懸液共200μL使ADM終濃度達10-7mol/L；加入ADM液及細胞懸液共200μL使ADM終濃度達10-8mol/L；加入ADM液及細胞懸液共200μL使ADM終濃度達10-9mol/L另設V(空白對照組)：上酶標儀檢測前，只加入含100 mL/L的胎牛血清的RPMI-16

4、40培養(yǎng)液200μL(不含細胞)。ADM作用后，每孔加入MTT液反應，再加入二甲基亞砜(DMSO)，后用酶標儀測定490nm波長的吸光度(A490)值。細胞抑制率(CPIR)=(1-實驗組平均A490值/對照組平均A490值)×100％。 2．免疫細胞化學法(SABC法)檢測細胞內增殖核抗原(proliferation cell nuclear antigen，PCNA)，細胞周期蛋白D1(cyclin D1)和細胞周期素依賴性

5、激酶抑制因子P21wafl的表達。取生長良好的HSC-T6，經0.25％胰酶消化，用培養(yǎng)基制備細胞懸液，種于6孔板中，每組設3個復孔。細胞待24h貼壁后，換用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基同步化處理24h后，加入ADM作用，根據作用時間不同分組為：Ⅰ組(12h組)；Ⅱ(24h組)；Ⅲ(48h組)。 又根據加入的ADM的量不同分組如下：A、B組，分別加入含100mL/L胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液的細胞懸液1mL(ADM為0

6、，即ADM對照組)；加入ADM液和細胞懸液使總量達1mL使其終濃度達ADM10-7mol/L。各組分別作用后，分別加入4％多聚甲醛室溫固定，加入0.3％Triton X-100作用，加入3％過氧化氫(H2O2)作用，后按照SABC試劑盒操作(其中陰性對照組加入蒸餾水代替一抗)，蘇木素復染，分化，梯度脫水，透明后用中性樹膠封片。 結果判定：胞核呈棕黃色為陽性，并對染色后的細胞片進行顯微鏡下觀察，攝片，Image-Pro Plus軟

7、件分析平均光密度，相對定量它們表達的強度。 結果： 1.MTT檢測ADM對HSC-T6細胞增殖的影響：統(tǒng)計學分析結果：在12h，24h，48h時間點ADM10-7mol/L組(其A490值分別為：Ⅰ B組0.162±0.037，ⅡB組0.136±0.018，ⅢB組0.134±0.018)與相應時間對照組(Ⅰ A組0.249±0.077，ⅡA組0.254±0.054，ⅢA組0.356±0.051)比較A490值明顯降低，差

8、異有顯著性(P<0.05：ⅠB vs ⅠA，t=10.646，ⅡB vs ⅡA，t=16.333，ⅢB vs ⅢA，t=24.516)，而其它濃度組與對照組比較差異均無顯著性(P>0.05)。ADM10-7mol/L各實驗組與Oh對照組(ⅣB組：0.195±0.052)相比差異有顯著性，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05：ⅠB，ⅡB，ⅢB vs ⅣB，t值分別為4.003，4.543，4.857)，其12h，24h，48h抑制率逐漸增加，分別

9、是7.88％，17.58％，18.79％，ADM10-7mol/L組隨著時間的延長HSC-T6的A490值逐漸降低，抑制率逐漸增加，對其抑制作用逐漸加強，各時間點之間兩兩比較24h和48h組各與12h組相比差異有顯著性(P<0.05：ⅡB，ⅢB vs ⅠB，q值分別為3.857，3.951)，24h組與48h組相比差異無顯著性(P>0.05：ⅡB vs ⅢB)。 2．免疫組化檢測HSC內PCNA，cyclin D1，P21waf

10、l表達的結果： ①PCNA：細胞經ADM 10-7mol/L濃度作用后，其PCNA蛋白表達明顯減弱，其胞核顏色明顯減淡，各時間點對照組(其平均光密度值分別為：ⅠA組0.370±0.032，ⅡA組0.387±0.023，ⅢA組0.405±0.019)與相應實驗組(IB組0.308±0.029，ⅡB組0.246±0.030，ⅢB組0.241±0.012)比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05：ⅠA vs ⅠB．ⅡA vs ⅡB，ⅢA

11、vs ⅢB，t值分別是4.107，5.149，5.232)，各實驗組時間點之間兩兩比較24h和48h組各與12h組相比差異有顯著性(P<0.05：ⅡB．ⅢB vsⅠ B，q值分別為5.100，6.633)，24h組與48h組相比差異無顯著性(P>0.05：ⅡB vs ⅢB)。 ②cyclin D1：細胞經ADM作用后其cyclin D1蛋白表達明顯減弱，其胞核顏色明顯減淡，各時間點對照組的平均光密度值分別為：ⅠA組0.450±0

12、.045，ⅡA組0.454±0.029，ⅢA組0.461±0.022，各相應實驗組的平均光密度值分別為：ⅠB組0.258±0.036，ⅡB組0.209±0.014，ⅢB組0.185±0.031，各對照組和實驗組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05：ⅠA vs ⅠB，ⅡA vs ⅡB，ⅢA vs ⅢB，t值分別是4.807，5.572，6.039)，各實驗組時間點之間兩兩比較24h和48h組與12h組差異無顯著性(P>0.05：ⅠB vs

13、 ⅡB vs ⅢB)。 ③P21wafl：細胞經ADM作用后其P21wafl蛋白表達增加強，其胞核顏色明顯加深，各時間點實驗組的平均光密度值(ⅠB組0.298±0.028，ⅡB組0.308±0.011，ⅢB組0.317±0.025)比對照組(ⅠA組0.195±0.034，ⅡA組0.201±0.033，ⅢA組0.212±0.029)明顯增加，統(tǒng)計學上差異有顯著性(P<0.05：ⅠA vs ⅠB，ⅡA vs ⅡB，ⅢA vs ⅢB，

14、t值分別是4.721，5.299，4.036)，各實驗組時間點之間兩兩比較差異無顯著性(P>0.05：ⅠB vs ⅡB vs ⅢB)。 ④ADM作用HSC后細胞內PCNA，cyclin D1，P21wafl三者表達的相關性分析：PCNA和cyclin D1的變化呈直線相關關系，有統(tǒng)計學意義(r=0.834，P<0.05)，具有正相關變化趨勢，PCNA和P21wafl變化呈直線相關關系，有統(tǒng)計學意義(r=-0.770，P<0.05

15、)，具有負相關變化趨勢，cyclin D1和P21wafl的變化呈直線相關關系，有統(tǒng)計學意義(r=-796，P<0.05)，具有負相關變化趨勢。 結論： ①腎上腺髓質素在10-7mol/L濃度作用于體外培養(yǎng)HSC可以抑制其增殖率，在24小時內呈時間依賴趨勢。 ②10-7mol/L濃度腎上腺髓質素作用HSC后，HSC細胞內PCNA，cyclin D1表達減弱，P21wafl表達增強。 ③10-7mol/L濃