1、背景:對(duì)長(zhǎng)段或多節(jié)段中小血管慢性阻塞而不適于血管腔內(nèi)干預(yù)的患者，采用血管旁路術(shù)行冠狀動(dòng)脈或肢體動(dòng)脈轉(zhuǎn)流手術(shù)，目前仍然是挽救患者生命和肢體功能的主要手段。自體靜脈是血管旁路移植物的金標(biāo)準(zhǔn)，與其他類型的移植物相比，自體靜脈最大的特質(zhì)就是靜脈血管術(shù)后對(duì)于動(dòng)脈環(huán)境的適應(yīng)性改變，這種適應(yīng)性改變通常被稱為“靜脈動(dòng)脈化”。自體靜脈移植物術(shù)后動(dòng)脈化的能力是其他人造移植物無(wú)法替代的。從1950年開始自體靜脈被廣泛應(yīng)用于缺血性疾病患者的血管重建手術(shù)，但是2

2、0-50％的靜脈移植物由于其手術(shù)以后的重塑過(guò)程導(dǎo)致血栓形成、再狹窄等，最終導(dǎo)致血管移植手術(shù)失敗。一旦血管重建術(shù)后再狹窄形成，就需要再次進(jìn)行血管移植術(shù)或血管內(nèi)支架置入術(shù)等血管重建手術(shù)，手術(shù)引起的血管損傷，日后仍會(huì)導(dǎo)致血管再狹窄形成。目前仍沒有有效的治療方法來(lái)減輕移植靜脈血管壁的過(guò)度增厚，移植血管再狹窄的機(jī)制及其防治措施一直是臨床研究的熱點(diǎn)。
　　從目前的研究結(jié)果來(lái)看，移植靜脈早期再狹窄與缺氧、手術(shù)過(guò)程損傷等原因?qū)е碌难軆?nèi)皮損傷部位

3、急性血栓形成有關(guān);移植靜脈中后期再狹窄與中膜血管平滑肌細(xì)胞、外膜成纖維細(xì)胞的遷移與增殖、細(xì)胞增生與凋亡失去平衡、新生內(nèi)膜過(guò)度增生密切相關(guān)。血管平滑肌細(xì)胞過(guò)度增殖并向內(nèi)膜遷移是新生內(nèi)膜增生的重要病理基礎(chǔ)，是各種因素導(dǎo)致血管重建術(shù)后血管再狹窄的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此，抑制血管平滑肌細(xì)胞過(guò)度增殖及遷移是防治靜脈移植術(shù)后再狹窄的有效策略。
　　移植靜脈內(nèi)膜增生的發(fā)生過(guò)程是多種細(xì)胞因子和血管活性物質(zhì)介導(dǎo)的局部血管重構(gòu)的過(guò)程，涉及到一系列復(fù)雜的病理過(guò)

4、程，目前臨床使用的藥物都未能有效降低再狹窄的發(fā)生率。基因轉(zhuǎn)移技術(shù)是防治移植靜脈新生內(nèi)膜過(guò)度增生的重要方法，選擇適當(dāng)?shù)陌谢蜻M(jìn)行局部轉(zhuǎn)染表達(dá)，針對(duì)血管再狹窄不同時(shí)期病變的進(jìn)程，抑制內(nèi)膜增生的病理過(guò)程。國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)作了許多這一方面的研究，但目前尚未找到一種滿意的移植血管基因轉(zhuǎn)移方法，實(shí)際應(yīng)用時(shí)如何選擇相應(yīng)的血管基因轉(zhuǎn)移技術(shù)（選取高效低毒的載體、提高轉(zhuǎn)染率、減輕副作用等），可能是今后研究的方向之一。
　　納米基因載體是將DNA、RNA

5、等治療分子包裹在納米顆粒之中或吸附在其表面，在細(xì)胞攝取作用下進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，實(shí)現(xiàn)目的基因持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)。可生物降解的PLGA（乳酸-乙醇酸共聚物）納米粒載藥系統(tǒng)因其具有緩釋作用而成為納米粒子研究中的熱點(diǎn)。但是由于治療基因多是高度親水的大分子物質(zhì)，將其包封于疏水性的PLGA納米粒中存在一定困難，而且DNA從疏水性的PLGA納米粒中的釋放過(guò)于緩慢，從而影響DNA的起效時(shí)間，因而有必要對(duì)PLGA進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾以提高其親水性，以改善載基因納米粒的包封

6、率和釋放性能。
　　Arresten基因是2000年由Colorado等研究發(fā)現(xiàn)的一種基底膜來(lái)源的內(nèi)源性血管生成抑制因子，由230個(gè)氨基酸殘基組成，其分子量約為26kD，是Ⅳ型膠原α1鏈的羧基末端NC1結(jié)構(gòu)域多肽片段。研究證實(shí)，arresten抑制新血管形成及腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移效果明顯，其活性為現(xiàn)今熱點(diǎn)研究中的Endostatin的3-10倍，因此，arresten被認(rèn)為是繼Endostatin之后新的極具潛力的血管生長(zhǎng)抑制因子。ar

7、resten在Ⅳ型膠原聚集、基底膜形成、調(diào)節(jié)細(xì)胞生物學(xué)行為方面發(fā)揮重要作用，能抑制內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。
　　綜合既往關(guān)于血管移植術(shù)后再狹窄和基因治療及納米載體研究的理論成果和結(jié)論，我們提出一個(gè)新的關(guān)于血管移植術(shù)后再狹窄治療的假設(shè):把a(bǔ)rresten基因治療和納米粒載體系統(tǒng)兩種方法聯(lián)合起來(lái)，利用經(jīng)過(guò)PEG修飾的PLGA納米粒子介導(dǎo)arresten基因局部轉(zhuǎn)染移植靜脈，增強(qiáng)基因耐核酸酶的能力，改善

8、載基因納米粒的包封率和釋放性能，延長(zhǎng)納米粒在體內(nèi)血液循環(huán)的時(shí)間。課題根據(jù)這一個(gè)假設(shè)進(jìn)行設(shè)計(jì)，擬明確納米粒介導(dǎo)arresten基因轉(zhuǎn)染對(duì)移植靜脈內(nèi)膜增生的影響，并研究其發(fā)揮作用的機(jī)制，從而為臨床提高血管重建術(shù)的中遠(yuǎn)期療效提供治療思路。
　　目的:研究構(gòu)建arresten基因真核表達(dá)載體;以PEG-PLGA為載體材料，制備出生物可降解型載基因納米粒;建立兔自體靜脈移植模型，局部定位轉(zhuǎn)染arresten基因納米粒，通過(guò)移植靜脈病理圖像分

9、析、病理組織學(xué)觀察、免疫組化分析、熒光定量PCR等手段，探討納米粒介導(dǎo)人arresten基因局部轉(zhuǎn)染對(duì)兔移植靜脈內(nèi)膜增生的作用及其可能的作用機(jī)制。
　　方法:
　　(1)設(shè)計(jì)arresten序列進(jìn)行人工合成，根據(jù)構(gòu)建需求在5'端添加ATG起始密碼子，并添加增強(qiáng)表達(dá)的kazak序列GCCACC，3'端去除終止密碼子，共計(jì)708bp，并在上游引入HindⅢ酶切位點(diǎn)，下游引入BamHⅠ酶切位點(diǎn)。序列合成后裝載至pUC57中間載體，

10、并進(jìn)行酶切及測(cè)序驗(yàn)證。雙酶切pUC57-arresten和pEGFP-N1質(zhì)粒，在T4DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接反應(yīng)。采用內(nèi)切酶BamHⅠ和EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定重組質(zhì)粒pEGFP-N1-arresten。取純化的重組質(zhì)粒樣品，進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定，以確認(rèn)目的基因序列是否正確。
　　(2)采用改良的納米粒沉淀法制備包封型載arresten基因PEG-PLGA納米粒。稱取20mgPEG-PLGA，接著將其溶解在1mlDMSO的溶液

11、中（含200“g的DNA），然后把此溶液在微量注射泵的配合下滴入20ml的F127(0.5％，w/v)的乳化劑中以制備載基因的納米?；鞈乙?。最后，混懸液經(jīng)低溫高速的離心作用后，收集其離心上清液應(yīng)用PicoGreen熒光分光光度法測(cè)定載基因納米粒的包封率及理化性質(zhì)。
　　(3)以新西蘭大白兔為研究對(duì)象，動(dòng)物隨機(jī)分為3組:空白組、對(duì)照組、arresten組，每組10只。采用游離的頸外靜脈間位移植至頸總動(dòng)脈的方法建立兔自體靜脈移植模型。

12、在行血管吻合術(shù)前，將移植段血管置于納米粒介導(dǎo)的重組質(zhì)粒pEGFP-N1-arresten溶液中浸泡，轉(zhuǎn)染移植靜脈。術(shù)后1周及術(shù)后4周分別應(yīng)用彩超觀察靜脈橋通暢情況。手術(shù)4周后取出移植靜脈，常規(guī)行HE及Masson染色，運(yùn)用計(jì)算機(jī)圖象分析技術(shù)來(lái)檢測(cè)兔移植靜脈的內(nèi)膜與中膜的厚度;采用免疫組化的方法來(lái)檢測(cè)金屬基質(zhì)蛋白酶-2(MMP-2)、金屬基質(zhì)蛋白酶-9(MMP-9)、平滑肌細(xì)胞肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、細(xì)胞增殖核抗原(PCNA)的陽(yáng)性表達(dá)情

13、況，熒光定量PCR方法檢測(cè)移植靜脈中arresten基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平。
　　結(jié)果:
　　(1)重組質(zhì)粒序列比對(duì)分析顯示，插入到表達(dá)載體的目的基因的序列與人arresten基因片段序列完全一致，目的基因序列正確，證明arresten基因準(zhǔn)確的克隆至表達(dá)載體中，試驗(yàn)成功地構(gòu)建出arresten基因真核表達(dá)載體pEGFP-N1-arresten。
　　(2)試驗(yàn)順利制備了一種包封型的載arresten基因的PEG-PLG

14、A納米粒。這種納米粒呈均勻的球形，納米粒的粒徑分布不寬，arresten基因能夠高效的包封于PEG-PLGA納米粒中（包封率96.64±0.202％），DNA的結(jié)構(gòu)得到保持。
　　(3)成功建立兔自體靜脈移植模型30只，手術(shù)過(guò)程無(wú)死亡，1只術(shù)后20天死于消化道感染，余均健康存活。29只存活動(dòng)物手術(shù)后無(wú)活動(dòng)功能障礙，術(shù)后精神、飲食、活動(dòng)正常，切口愈合好，無(wú)紅腫、滲出或膿腫形成。取材前檢查存活動(dòng)物移植靜脈27例通暢，靜脈搏動(dòng)良好，血管

15、與周圍組織有粘連，未見移植靜脈破裂，無(wú)深部感染，1例移植靜脈重度擴(kuò)張導(dǎo)致血管瘤形成，2例閉塞。術(shù)后第1、4周分別觀察到1只動(dòng)物移植靜脈閉塞。切取標(biāo)本行熒光定量PCR，結(jié)果顯示重組質(zhì)粒pEGFP-N1-arresten轉(zhuǎn)染的血管組織中有目的基因mRNA的表達(dá);通過(guò)病理計(jì)算機(jī)圖象技術(shù)分析可知，轉(zhuǎn)染arresten納米粒組的內(nèi)膜厚度以及中膜厚度均分別比對(duì)照組、空白組小，轉(zhuǎn)染arresten納米粒組的內(nèi)膜增生的程度分別比空白組、對(duì)照組輕(P＜0

16、.05)。血管平滑細(xì)胞是增生內(nèi)膜中主要的細(xì)胞;轉(zhuǎn)染arresten納米粒組的移植靜脈的PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量與表達(dá)指數(shù)，均比空白組、對(duì)照組更小(P＜0.05);轉(zhuǎn)染arresten納米粒組的MMP-2及MMP-9表達(dá)均少于空白組及對(duì)照組(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　采用改良的納米粒沉淀法成功制備了包封型載pEGFP-N1-Arresten基因PEG-PLGA納米粒，質(zhì)粒DNA可以行之有效地包封在PEG-

17、PLGA納米粒里面（研究結(jié)果顯示，這種包封率超過(guò)95％），也較好地保持了DNA結(jié)構(gòu)的完整性。采用游離的頸外靜脈間位移植至頸總動(dòng)脈的方法可以成功建立兔自體靜脈移植模型，具有成功率高、損傷小、圍手術(shù)期死亡率低等優(yōu)點(diǎn)。采用移植靜脈浸泡于基因納米粒中的方法可以成功將目的基因?qū)胍浦察o脈細(xì)胞中，PEG-PLGA納米粒可以介導(dǎo)局部定位轉(zhuǎn)染人arresten基因，從而有效抑制兔移植靜脈內(nèi)膜的增生，人arresten基因抑制兔移植靜脈內(nèi)膜的增生的作用機(jī)