MyD88在特定細胞型中對肥胖相關炎癥疾病的作用.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、實驗背景:低濃度的全身性炎癥反應在肥胖相關炎癥疾病如胰島素抵抗及主動脈粥樣硬化病變發(fā)展過程中起關鍵作用,并且與代謝綜合征的發(fā)生呈相關性。高脂肪飲食(HFD)能影響腸道通透性,引發(fā)全身性炎癥刺激因子的聚集,這些刺激因子包括了白介素-1受體(IL-1R)/toll樣受體(TLRs)的內源性與外源性配基。并且已有既往研究證實了IL-1R/TLRs信號通路在高脂飲食致全身性炎癥反應及肥胖致炎癥疾病發(fā)展中均起著關鍵作用。
  實驗目的:本研

2、究中,我們旨在探索TLR-MyD88(髓樣分化因子88,myeloiddifferentiation factor88,IL-1 R/TLRs主要銜接分子)信號通路是如何在不同細胞類型中協(xié)調性地參與HFD誘導的全身性炎癥反應及代謝性炎癥疾病的起始階段。
  實驗方法:我們應用Cre-LoxP基因敲除技術得到內皮細胞特異性MyD88基因敲除小鼠(MyD88EC-KO)及骨髓/巨噬細胞特異性MyD88基因敲除小鼠(MyD88MC-KO

3、).我們又將MyD88EC-KO小鼠與MyD88MC-KO小鼠與載脂蛋白E基因敲除小鼠(ApoE-/-)雜交得到MyD88EC-KO ApoE-/-小鼠和MyD88MC-KO ApoE-/-小鼠.這些小鼠被給予正常飲食或高脂飲食(HFD,從小鼠6周大開始)三個月以建立飲食致肥胖模型及主動脈粥樣硬化疾病模型。我們對實驗小鼠檢測了包括體重、體脂肪量、血脂水平及血糖/胰島素濃度等代謝指標,同時應用葡萄糖/胰島素耐量試驗來評估其對胰島素的敏感性

4、。我們向小鼠腹腔注射胰島素或生理鹽水后收集脂肪組織、肌肉組織及肝臟組織,并用western-blot檢測胰島素對IRS-1-PI3K-AKT信號通路的激活。為了檢測HFD誘導的全身炎癥反應,用ELISA檢測血漿內促炎癥細胞因子的蛋白水平。通過免疫組化染色觀察實驗小鼠脂肪組織中巨噬細胞的浸潤量,且進一步對基質血管成分細胞染色并予以細胞流式分析巨噬細胞亞型。在主動脈粥樣硬化模型中,對實驗小鼠主動脈進行油紅O染色,用photoshop軟件分析

5、圖像并計算各基因組平均病變面積。通過免疫熒光染色結合共聚焦顯微鏡檢查病灶內巨噬細胞-粒細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)與內皮細胞表面標記CD31共定位。我們建立脂肪細胞和巨噬細胞共培養(yǎng)的方法并且用游離脂肪酸(FFAs)/細菌脂多糖(LPS)刺激巨噬細胞來證實巨噬細胞及脂肪細胞間的相互作用。另一方面,我們提取氧化低密度脂蛋白(oxided l

6、ow density lipo-ptortein,ox-LDL)刺激后內皮細胞的上清液培養(yǎng)單核/巨噬細胞或直接用ox-LDL刺激GM-CSF促分化的巨噬細胞而闡明內皮細胞及巨噬細胞間的相互作用。上述實驗中,RT-PCR用來檢測組織/細胞中炎癥基因及M1/M2巨噬細胞亞型標志基因的表達水平,而western-blot用來分析各信號通路的激活程度。
  實驗結果:在高脂飲食小鼠模型中,對骨髓細胞來源MyD88基因的特異性敲除(MyD8

7、8MC-KO)能降低全身性炎癥反應、胰島素抵抗及主動脈粥樣硬化的程度,同時也能減少脂肪組織中巨噬細胞(ATM)的浸潤及ATM從M2抗炎癥巨噬細胞亞型向M1促炎癥亞型的轉變。在此基礎上,我們進一步證實了巨噬細胞和脂肪細胞間存在相互作用,而脂肪細胞通過巨噬細胞內MyD88介導的信號通路誘導其M1相關基因的表達。另一方面,內皮細胞特異性敲除MyD88基因小鼠(MyD88EC-KO)體內M1亞型ATM數量,全身炎癥反應及主動脈粥樣硬化程度與對照

8、組小鼠相比也有一定程度的降低,但不及MyD88MC-KO小鼠表型明顯。同時體內及體外實驗均表明,內皮細胞來源MyD88依賴生成的GM-CSF因能促使脂肪組織及主動脈組織內巨噬細胞極化為M1亞型而在肥胖致全身性炎癥反應及主動脈粥樣硬化發(fā)展的起始階段扮演著重要角色。
  實驗結論:總而言之,這些結果都證明了MyD88介導的信號途徑在高脂飲食誘導全身性炎癥反應及代謝性炎癥疾病發(fā)生發(fā)展的過程中對脂肪細胞、巨噬細胞及內皮細胞三者間相互聯(lián)系起

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