1、泛素化是真核生物中最重要的翻譯后修飾之一。泛素化過(guò)程除了參與蛋白酶體降解之外，還參與調(diào)節(jié)許多生物學(xué)過(guò)程，包括細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，DNA修復(fù)，信號(hào)傳導(dǎo)和蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用。泛素化過(guò)程通過(guò)多步酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)。在這一過(guò)程中，泛素連接酶(E3)決定了泛素化底物識(shí)別的特異性。然而多數(shù)E3的底物尚不清楚。鑒定這些底物是當(dāng)前泛素化研究的主要難點(diǎn)。目前，多數(shù)底物的是在不同實(shí)驗(yàn)室用不同的方法逐一鑒定出來(lái)的，需要更好，更快，更經(jīng)濟(jì)的高通量方法鑒定E3底物。

2、r>　　 目前已經(jīng)有幾種高通量研究E3底物的方法，包括，1.利用蛋白質(zhì)芯片作為底物高效篩選E3底物;2.體內(nèi)（in vivo）非標(biāo)記定量或SILAC(Stable IsotopeLabeling by Amino Acid)標(biāo)記定量質(zhì)譜的方法;3.體內(nèi)GPSP(Global ProteinsStability profiling)的方法。在本研究中，我們建立了與上述方法不同的兩種較高通量鑒定泛素連接酶底物的新策略。
　　 許多

3、E3特異性識(shí)別底物是通過(guò)他們的蛋白質(zhì)相互作用結(jié)構(gòu)域?qū)崿F(xiàn)的，在本論文的前一部分，我們建立了一套在蛋白質(zhì)組水平上系統(tǒng)鑒定含蛋白質(zhì)相互作用結(jié)構(gòu)域的泛素連接酶底物的策略（見圖1）。本策略通過(guò)篩選隨機(jī)多肽文庫(kù)鑒定蛋白質(zhì)相互作用結(jié)構(gòu)域的配體結(jié)合特性。通過(guò)構(gòu)建了一系列人工底物(artificialdegron)，包括一個(gè)可以被泛素化的序列和一系列識(shí)別底物的序列用于體外泛素化實(shí)驗(yàn)。通過(guò)這一策略，除了底物之外還能鑒定到非底物調(diào)節(jié)蛋白。該策略還能鑒定到底物

4、識(shí)別的詳細(xì)機(jī)制，這對(duì)于藥物的研發(fā)很有幫助。本課題中以LNX(Ligand of Numb protein X)家族E3（一組含有PDZ結(jié)構(gòu)域的RING-type泛素連接酶）為例，來(lái)闡述和驗(yàn)證這一策略。我們鑒定到大量LNX1的潛在底物;在選出的9個(gè)候選底物中，8個(gè)在體外泛素化實(shí)驗(yàn)中被LNX1泛素化。在進(jìn)一步的細(xì)胞內(nèi)驗(yàn)證中，本研究驗(yàn)證出兩個(gè)LNX1內(nèi)源底物—PBK和BCR。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明LNX1催化PBK的泛素化和降解，抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)阿

5、霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。我們還描述了LNX1識(shí)別底物的詳細(xì)機(jī)制，即LNX1通過(guò)哪個(gè)PDZ結(jié)合底物。這一策略作為一個(gè)在蛋白質(zhì)組水平上系統(tǒng)鑒定E3底物的有力工具，能夠擴(kuò)展到其他含有蛋白質(zhì)相互作用結(jié)構(gòu)域的泛素連接酶的研究。
　　 在本文的后一部分，我們建立了另一套較高通量鑒定E3底物的新策略（見圖2）。該策略利用活噬茵體展示文庫(kù)做為E3底物進(jìn)行篩選。本研究以MDM2為例闡述和驗(yàn)證該策略。通過(guò)4次不同方法的篩選，本策略鑒定到MDM2的16個(gè)

6、天然潛在底物和許多非天然潛在底物。有些底物可以在不同的實(shí)驗(yàn)中重復(fù)篩選到。在選出的12個(gè)候選底物中，10個(gè)在體外泛素化體系中被MDM2泛素化。在進(jìn)一步的細(xì)胞內(nèi)驗(yàn)證中，本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證出三個(gè)MDM2的新底物蛋白—DDX42，TP53RK和RPL36a。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)了MDM2促進(jìn)TP53RK泛素化導(dǎo)致其被蛋白酶體的降解。在本策略中，除了多聚底物之外，還能鑒定到更多的MDM2單泛素化或寡聚泛素化底物。只要某一個(gè)E3適合體外泛素化系統(tǒng)，且不泛素化空