1、錳是機體代謝的必需微量元素之一，適量的錳在體內充當某些酶的活性基團、激活因子等，同時參與中樞神經(jīng)的生理功能。錳及其化合物又是重要的工業(yè)原料，應用廣泛，常用于電焊作業(yè)以增強焊接的硬度和強度。工業(yè)中錳過量接觸會導致職業(yè)性錳中毒的發(fā)生，對機體的神經(jīng)、免疫、生殖等各方面造成損傷。我國錳的消耗量超過千萬噸，職業(yè)性慢性錳中毒的發(fā)生率較高，給國家造成巨大經(jīng)濟損失。目前慢性錳中毒無經(jīng)濟有效的治療方法，而且國家對其診斷無統(tǒng)一有效的標準，早期外周組織相應的

2、標志物檢測亦無相應的有力證據(jù)。之前的大多數(shù)研究都是檢測工作場所周圍空氣中的平均錳濃度，而忽略了個體錳實際暴露劑量的測定。本課題即是從個體錳實際暴露劑量出發(fā)，研究暴露劑量與生物材料中各指標之間的相關性，以尋找合適的生物標志物為錳的接觸評價提供依據(jù)。 目的： 建立一種能同時測定人尿液中高香草酸和香草扁桃酸含量的高效液相色譜熒光檢測方法，并探討錳接觸工人個體實際接觸劑量與生物指標之間的關系以尋找合適的早期生物學監(jiān)測指標。

3、 方法： 本課題選擇濟南市某機車車輛廠電焊作業(yè)工人270名，其中男238人，女32人，均排除各種肝、腎疾病，無其他毒物接觸史，無長期藥物服用史。收集此270人的血液和尿液進行分析。 對尿液中高香草酸和香草扁桃酸的測定進行方法學摸索和驗證。根據(jù)文獻參考，選擇高效液相色譜—熒光檢測器的方法測定。尿樣經(jīng)0．45μm濾膜過濾后直接進樣，經(jīng)ODS色譜柱（250 mm×4．6 mm，5．0μm）室溫分離，以甲醇—0．1 mol/L

4、 pH=5．6的磷酸鹽緩沖液（體積比20：80）為流動相，流量1 ml/min，進樣量10μl，激發(fā)波長277 nm，發(fā)射波長320 nm。 火焰原子吸收光譜法測定血錳、尿錳和個體錳暴露劑量；高效液相色譜—熒光法測定尿中高香草酸和香草扁桃酸；從血液中提取DNA進行谷氨酸脫羧酶67（GAD67）和血紅素加氧酶—1（HO—1）基因多態(tài)性分析，GAD67采用PCR結合限制性內切酶（MnlⅠ）進行片段長度多態(tài)性（RFLP）分析；HO—1

5、則通過研究啟動子（GT）序列的長度進行多態(tài)性分析。對各指標進行相關性研究和方差分析。 結果： 尿中高香草酸和香草扁桃酸的分離測定過程在15 min之內完成，香草扁桃酸、高香草酸保留時間分別為3．18、6．54 min。高香草酸檢出限為0．15μg/ml。線性范圍0～25μg/ml，加標回收率84．5%～102．1%，相對標準偏差<3．44%。香草扁桃酸檢出限為0．13μg/ml，線性范圍0—20μg/ml，加標回收率94

6、．7%～101．3%，相對標準偏差<2．16%。 個體錳與血錳、尿錳之間均無相關性，提示血錳、尿錳均不能作為評價錳實際接觸劑量的指標，即不能作為評價錳接觸的暴露生物標志。 個體錳暴露劑量與尿HVA之間有負相關性（r=—0．168，P<0．01），且有顯著統(tǒng)計學意義；與尿中HVA、VMA的均值有負相關性（r=—0．172，P<0．01），且有顯著統(tǒng)計學意義。提示尿HVA、尿中二酸均值隨著個體錳接觸劑量的增加呈下降趨勢，二者

7、均可以作為職業(yè)性錳中毒診斷的效應生物標志物指標評價錳接觸的情況。 DNA經(jīng)擴增、MnlⅠ酶切后將GAD67分為CC、TC、TT三種基因型，共測定132份樣品。按個體錳暴露將其分為高、低兩組，分析組內各基因型對應的工人尿HVA、HVA與VMA均值之間的差異。方差分析結果無統(tǒng)計學差異，提示GAD67的MnlⅠ酶切位點不能作為評價錳接觸的遺傳易感性生物標志。 DNA經(jīng)擴增、銀染后將HO—1的啟動子重復序列長度分為S/S，S/M

8、，S/L，M/M，M/L和L/L六種基因型，共測定樣品132份。按個體錳暴露將其分為高、低兩組，分析組內各基因型對應的工人尿HVA、HVA與VMA均值之間的差異，方差分析結果無統(tǒng)計學差異。按是否含有L等位基因把六種基因型分為兩類基因型，比較兩組內工人尿HVA、HVA與VMA均值之間的差異，t檢驗結果顯示兩組內的兩類基因型之間均有統(tǒng)計學差異，提示HO—1基因的L等位基因可以作為評價錳接觸的遺傳易感性生物標志。 結論： 本實

9、驗樣品前處理簡單，樣品穩(wěn)定，保存時間長；方法靈敏度高、重現(xiàn)性好。完成一次樣品分析需要15 min，標準曲線線性良好。方法各項指標均達到《生物材料分析方法的研制準則》的要求，能準確測定尿液中高香草酸和香草扁桃酸的含量，適用于大批樣品的測定。 血錳、尿錳均不能作為評價錳接觸的暴露生物標志；尿HVA、尿中HVA與VMA的均值都可以作為評價錳接觸的效應生物標志，尿VMA則不可以；年齡、性別是錳接觸效應發(fā)生的重要影響因素。GAD67 Mn