1、本文旨在研究缺氧誘導(dǎo)因子-2α(hypoxiainduciblefactor-2alpha，HIF-2α)mRNA和蛋白在肝癌組織中的定性和定量表達(dá)，及其與肝癌組織臨床病理指標(biāo)的相關(guān)關(guān)系，探討其在肝癌組織中表達(dá)的臨床意義；通過檢測(cè)并比較缺氧狀態(tài)下肝癌SMMC-7721細(xì)胞中HIF-1α和HIF-2α在不同時(shí)相的mRNA和蛋白量以及兩者的半衰期，探討HIF-1α和HIF-2α的時(shí)相差異表達(dá)意義及其可能的調(diào)節(jié)機(jī)制；并通過阻斷HIF-2α在肝

2、癌SMMC-7721細(xì)胞中的表達(dá)，研究HIF-2α對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、黏附和侵襲能力的影響。 第一部分 HIF-1α和HIF-2α在肝癌細(xì)胞中的時(shí)相差異表達(dá) 目的：缺氧誘導(dǎo)因子2α與缺氧誘導(dǎo)因子1α結(jié)構(gòu)功能相似卻不可相互替代；兩者在缺氧過程中的表達(dá)不一致。本研究在檢測(cè)缺氧狀態(tài)下肝癌細(xì)胞中HIF-2α和HIF-1α的時(shí)相表達(dá)差異并探討其可能的調(diào)節(jié)機(jī)制和意義。 方法：以1％低氧培養(yǎng)箱模擬細(xì)胞低氧環(huán)境，檢測(cè)人肝癌S

3、MMC-7721細(xì)胞中HIF-1α和HIF-2αmRNA量和蛋白量，以及反義HIF-1α(naturalantisensehypoxiainduciblefactor-1α，aHIF)的mRNA量。同時(shí)應(yīng)用氯化鈷(CoCl2)和轉(zhuǎn)錄抑制劑5，6-二氯苯并咪唑1-beta-D-呋喃核糖苷(5，6-dichlorobenzimidazole-1-beta-d-ribofuranoside，DRB)檢測(cè)HIF-1α和HIF-2αmRNA的半衰

4、期，評(píng)價(jià)HIF-1α和HIF-2αmRNA的穩(wěn)定性。 結(jié)果：急性缺氧迅速誘導(dǎo)HIF-1α蛋白和HIF-2α蛋白在細(xì)胞內(nèi)堆積。隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng)HIF-1αmRNA的穩(wěn)定性下降，其蛋白表達(dá)降低，而HIF-2αmRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)以及aHIFmRNA持續(xù)增高。 結(jié)論：在較長(zhǎng)時(shí)相的缺氧過程中，針對(duì)于腫瘤細(xì)胞對(duì)缺氧的適應(yīng)性調(diào)節(jié)，以及在腫瘤的放療和化療抗性以及與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移方面，HIF-2α可能比HIF-1α起著更為重要的作用。

5、aHIF參與了HIF-1αmRNA的負(fù)反饋調(diào)節(jié)。 第二部分 HIF-2α在肝癌組織中的表達(dá)及其臨床意義 目的：研究缺氧誘導(dǎo)因子-2α(HIF-2α)mRNA及蛋白在肝癌組織中的表達(dá)。 方法：半定量RT-PCR法和免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)67例肝細(xì)胞肝癌(HCC)標(biāo)本中HIF-2αmRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白的表達(dá)。 結(jié)果：在67例肝癌標(biāo)本中，HIF-2α陽性表達(dá)率為40.3％(27/67)，其陽性染色在肝癌細(xì)

6、胞、腫瘤新生血管內(nèi)皮中，主要在胞漿中表達(dá)，胞核中表達(dá)較少。在有肝癌壞死周邊組織中表達(dá)陽性率較高。統(tǒng)計(jì)分析顯示hif-2αmRNA轉(zhuǎn)錄和HIF-2α蛋白表達(dá)在大小肝癌之間、播散型與非播散型肝癌之間以及伴有壞死和無壞死肝癌之間均有顯著性差異(P＜0.05)；但肝癌各病理組織分級(jí)之間以及是否有肝門淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間無顯著性差異(P＞0.05)。相關(guān)分析顯示hif-2αmRNA轉(zhuǎn)錄與HIF-2α蛋白表達(dá)有顯著性相關(guān)(r=0.264，P＜0.05)。

7、結(jié)論：HIF-2α在肝癌組織中的表達(dá)較為普遍，其表達(dá)增高與肝癌的惡性生長(zhǎng)有關(guān)，同時(shí)亦可能是促進(jìn)肝癌細(xì)胞浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的一個(gè)因素。 第三部分 HIF-2α對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲能力的影響 目的：檢測(cè)在缺氧條件下缺氧誘導(dǎo)因子2α對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞生長(zhǎng)、黏附和侵襲能力的影響。 方法：以1％低氧培養(yǎng)箱模擬細(xì)胞低氧環(huán)境下脂質(zhì)體Lipofectamine介導(dǎo)HIF-2α脫氧寡核苷酸轉(zhuǎn)染SMMC-7721肝癌細(xì)胞，測(cè)

8、轉(zhuǎn)染前后HIF-2αmRNA量和蛋白量檢驗(yàn)轉(zhuǎn)染效果；MTT法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)和粘附能力變化；Transwell小室測(cè)定細(xì)胞的體外侵襲能力。 結(jié)果：HIF-2αmRNA和蛋白表達(dá)在反義轉(zhuǎn)染組顯著低于正義組、隨機(jī)組與對(duì)照組(P＜0.01)。HIF-2α表達(dá)阻斷對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和活力無顯著性影響(P＞0.05)，但顯著抑制體外粘附能力(抑制率16.99％～31.07％，P＜0.01)和侵襲能力(抑制率17.9％，P＜0.01)。 結(jié)論：