1、目的：構(gòu)建人p16cDNA重組真核表達載體。探討轉(zhuǎn)入外源性p16cDNA對人原發(fā)性肝癌SMMC-7721細胞生物學行為的影響及其抑制細胞生長的機制。方法：從pBS-p16克隆載體中，將人p16cDNA亞克隆入真核表達載體pcDNA3.1(+),構(gòu)建含人p16cDNA的重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-p16，并經(jīng)雙酶切和測序鑒定。將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人SMMC-7721細胞，經(jīng)G418抗性篩選和擴增得到穩(wěn)定表達p16的亞細胞株及穩(wěn)定表達pcD

2、NA3.1(+)的對照亞細胞株，并經(jīng)RT-PCR及免疫細胞化學鑒定。通過細胞計數(shù)法，流式細胞術(shù)，免疫細胞化學及Westernblot等實驗方法，對外源性p16基因?qū)肴烁伟┘毎蟮募毎飳W行為及細胞周期調(diào)控因子CyclinD1及pRb進行觀察。結(jié)果：成功地構(gòu)建含人p16cDNA的重組表達質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-p16，測序證明p16cDNA編碼序列與Genbank中報道的序列一致。轉(zhuǎn)染外源性p16基因的SMMC-7721細胞有外源

3、性p16基因的整合及表達，細胞生長速度明顯減慢，細胞群體倍增時間明顯延長(37.8hvs24.3h)，G1期細胞明顯多于轉(zhuǎn)基因前(57.9％vs41.5％)(P＜0.05)；免疫細胞化學檢測顯示外源性p16表達可下調(diào)cylinD1的表達(P＜0.05)，Westernblot分析提示轉(zhuǎn)染外源性p16基因后細胞中磷酸化pRb水平明顯降低。結(jié)論：1、成功構(gòu)建含人p16cDNA的重組表達質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-p16；2、外源性p16基因