1、目的:觀察中藥復方硝苦湯外用對兔背部人糞污染手術(shù)創(chuàng)面愈合指數(shù)、成纖維細胞數(shù)量、毛細血管數(shù)量、TGF-β1蛋白含量和EGF蛋白含量的影響,驗證硝苦湯外用促進痔瘺手術(shù)模型創(chuàng)面愈合及其預防創(chuàng)面過度瘢痕化的作用,探討硝苦湯促進創(chuàng)面愈合和抑制創(chuàng)面過度瘢痕化的機理。
　　 方法:1.創(chuàng)面模型的制作與分組:新西蘭大白兔16只,雌雄各半,電子秤稱重,實驗兔兩側(cè)背部用8％硫化鈉脫毛,再用25％烏拉坦(4ml／kg)麻醉。麻醉成功后在兔背中部脊柱兩

2、側(cè)旁開1.5cm,由前至后各切割2個圓形全層皮膚創(chuàng)面,直徑1.8cm,面積1.54cm2。充分止血后在創(chuàng)面上加糞液1ml(正常人新鮮糞便10g,加生理鹽水5ml,混勻,離心,取其上清液而成。糞液每日現(xiàn)配現(xiàn)用),以油紗、敷料覆蓋,膠帶固定,48小時后觀察創(chuàng)面,參照文獻見創(chuàng)面有膿性分泌物及有糞臭味者即為造模成功。將上述每只模型兔4個創(chuàng)面隨機分為4組(每組16個創(chuàng)面):A組為生理鹽水組(空白對照組),B組為rhEGF治療組,C組為中藥硝苦湯治

3、療組,D組為綜合治療組(中藥+rhEGF)。2.給藥:從造模成功后第二天開始給藥。A組:每日涂生理鹽水一次,再以敷料覆蓋,膠帶固定,每日換藥一次,直至創(chuàng)面愈合。B組:均勻噴涂rhEGF(120AU／cm2)1次于創(chuàng)面上,余同A組。C組:涂硝苦湯40mg／cm2,余同A組。D組:均勻噴涂rhGF(120AU／cm2),30分鐘后涂硝苦湯(40mg／cm2),余同A組。以上各組每次用藥前半小時均在創(chuàng)面上涂糞液1ml,且每天用藥前均常規(guī)清潔創(chuàng)

4、面,同一時間用藥1次。3.取材:于用藥后第4,6,8,10,12,14,16,18天測量創(chuàng)面面積,計算出愈合指數(shù),然后隨機取1只動物(共8只),麻醉(烏拉坦4ml／kg)成功后處死,用眼科手術(shù)剪分離創(chuàng)面新生肉芽組織,并成塊取下,標本用10％中性福爾馬林固定24小時后,用75％的酒精浸泡24小時,再將標本浸泡到70％的酒精中待檢(進行成纖維細胞數(shù)量,毛細血管數(shù)量計數(shù),EGF蛋白表達的檢測)。剩下8只動物于創(chuàng)面愈合后第1,2,3,4,5,6

5、,7,8天分別處死一只動物,用眼科手術(shù)剪分離創(chuàng)面瘢痕組織,并成塊取下,用上法處理后待檢(檢測TGF-β1蛋白的表達)。4.檢測:取出標本,石蠟包埋,分別進行HE染色,然后進行對照病理檢測(成纖維細胞數(shù)量、毛細血管數(shù)量)；同時進行即用型SABC法免疫組化染色(同一試劑盒),分別對各免疫組化切片進行TGF—β1、EGF蛋白表達檢測,所得免疫組化圖片用IPP圖像分析系統(tǒng)分析,結(jié)果以平均灰度值表示。5.觀察指標:①創(chuàng)面愈合指數(shù)(Healingi

6、ndex)；②創(chuàng)面肉芽組織成纖維細胞數(shù)量(the number of Fibroblasts)；③創(chuàng)面肉芽組織毛細血管數(shù)量(the number of Capillary)；④創(chuàng)面肉芽組織EGF蛋白表達含量(fepidermal cell factor)；⑤創(chuàng)面瘢痕組織TGF-β1蛋白表達含量(Transforming growth factor)。6.統(tǒng)計學方法:實驗所得數(shù)據(jù)均以(x)±s表示,用t檢驗比較組間差異,P<0.05被認為

7、差異具有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果:1.對創(chuàng)面愈合指數(shù)的影響:①硝苦湯治療組創(chuàng)面的平均愈合指數(shù)與生理鹽水組比較(t=2.97,P<0.05),差異有顯著性,有統(tǒng)計學意義；與綜合治療組比較(t=2.19,P<0.05),差異有統(tǒng)計學意義；與rhEGF治療組比較(t=0.09,P>0.05),差異無顯著性,無統(tǒng)計學意義。②生理鹽水組與rhEGF治療組比較(t=2.66,P<0.05),差異有顯著性,有統(tǒng)計學意義；與綜合治療組比較(t=

8、4.36,P<0.05),差異有統(tǒng)計學意義。③rhEGF治療組與綜合治療組比較(t=2.20 P<0.05),差異有顯著性,有統(tǒng)計學意義。2.對成纖維細胞數(shù)量的影響:①硝苦湯治療組創(chuàng)面的平均成纖維細胞數(shù)量與生理鹽水組比較,差異有顯著性,有統(tǒng)計學意義(t=17.47,P<0.001)；與綜合治療組比較,差異有顯著性,有統(tǒng)計學意義(t=2.67,P<0.05)；與rhEGF治療組比較,差異無顯著性,無統(tǒng)計學意義(t=0.26,P>0.05)

9、。②生理鹽水組與rhEGF治療組比較,差異有顯著性,有統(tǒng)計學意義(t=18.06,P<0.001)；與綜合治療組比較,差異有顯著性,有統(tǒng)計學意義(t=20.86,P<0.05)。③rhEGF治療組與綜合治療組比較,差異有顯著性,有統(tǒng)計學意義(t=2.32,P<0.05)。3.對毛細血管數(shù)量的影響:①硝苦湯治療組創(chuàng)面的平均毛細血管數(shù)量與生理鹽水組比較,差異有顯著性,有統(tǒng)計學意義(t=7.84,P<0.01)；與綜合治療組比較,差異有顯著性

10、,有統(tǒng)計學意義(t=2.42,P<0.05)；與rhEGF治療組比較,差異無顯著性,無統(tǒng)計學意義(t=0.29,P>0.05)。②生理鹽水組與rhEGF治療組比較,差異有顯著性,有統(tǒng)計學意義(t=7.74,P<0.001)；與綜合治療組比較,差異有顯著性,有統(tǒng)計學意義(t=10.37,P<0.001)；③rhEGF治療組與綜合治療組比較,差異有顯著性,有統(tǒng)計學意義(t=2.75,P<0.05)。4.各組肉芽組織EGF蛋白表達(灰度值)的

11、變化:①硝苦湯治療組與生理鹽水組比較,差異有顯著性,有統(tǒng)計學意義(t=7.20,P<0.01)；與綜合治療組比較,差異有顯著性,有統(tǒng)計學意義(t=2.34,P<0.05)；與rhEGF治療組比較,差異無顯著性,無統(tǒng)計學意義(t=0.04,P>0.05)。②生理鹽水組與rhEGF治療組比較,差異有顯著性,有統(tǒng)計學意義(t=7.38,P<0.001)；與綜合治療組比較,差異有顯著性,有統(tǒng)計學意義(t=13.03,P<0.001)。③rhEG

12、F治療組與綜合治療組比較,差異有顯著性,有統(tǒng)計學意義(t=2.36,P<0.05)。5.對TGF-β1蛋白表達(灰度值)的影響:①硝苦湯治療組與生理鹽水組比較,差異有顯著性,有統(tǒng)計學意義(t=7.30,P<0.001)；與綜合治療組,差異有顯著性,有統(tǒng)計學意義(t=5.48,P<0.001)；與rhEGF治療組比較,差異無顯著性,無統(tǒng)計學意義(t=0.29,P<0.001)。②生理鹽水組與rhEGF治療組比較,差異有顯著性,有統(tǒng)計學意義

13、(t=2.98,P<0.01)；與綜合治療組比較,差異有顯著性,有統(tǒng)計學意義(t=0.29,P>0.05)。③rhEGF治療組與綜合治療組比較,差異有顯著性,有統(tǒng)計學意義(t=2.76,P<0.05)。
　　 結(jié)論:1.本研究表明硝苦湯能夠促進兔背部人糞污染手術(shù)創(chuàng)面的愈合；2.本實驗證實硝苦湯能夠預防兔背部人糞污染手術(shù)創(chuàng)面愈合后過度瘢痕化；3.實驗結(jié)果顯示硝苦湯促進創(chuàng)面愈合可能與促進創(chuàng)面EGF和TGF-β1的表達有關(guān)；4.硝苦湯