1、水體富營養(yǎng)化導(dǎo)致的水華暴發(fā)不僅嚴(yán)重毒害水生生物，使整個水體生態(tài)失衡，并且能夠通過被污染的水產(chǎn)品，農(nóng)產(chǎn)品或者有毒的飲用水間接或直接危害人類的健康。微囊藻毒素(microcystin，MC)是水華暴發(fā)時藍(lán)藻的一些屬產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，很難將其從水中除去，該毒素具有多種毒性效應(yīng)，因此深入研究其致毒機(jī)理具有非常重要的意義。
　　 微囊藻毒素是一種單環(huán)七肽類化合物，其中5個氨基酸為固定成分，X，Y為兩種可變氨基酸，由此可產(chǎn)生

2、80多種異構(gòu)體。微囊藻毒素LR(MC-LR)是微囊藻毒素中存在最為普遍且毒性作用最明顯的一種，L，R分別代表亮氨酸，精氨酸。微囊藻毒素的致毒效應(yīng)表現(xiàn)出明顯的器官選擇性，肝臟是微囊藻毒素最主要的靶器官。急性暴露于微囊藻毒素引起肝臟腫大，肝內(nèi)出血甚至肝功能衰竭；流行病學(xué)調(diào)查表明，低濃度的微囊藻毒素長時間暴露與人群中肝癌的發(fā)生密切相關(guān)。微囊藻毒素的肝毒性是由于肝臟中表達(dá)特殊的有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽系統(tǒng)(organicaniontransporti

3、ngpolypeptides，OATPs)，可將微囊藻毒素大量地轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞。此外，除了肝臟毒性之外，微囊藻毒素還具有腎毒性、腸毒性、生殖毒性、神經(jīng)毒性，引起腎上腺，腸道相關(guān)疾病、生殖系統(tǒng)以及神經(jīng)系統(tǒng)損傷等。
　　 對徼囊藻毒素致毒機(jī)理的研究表明，微囊藻毒素能夠引起細(xì)胞骨架的改變、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)活性氧(ROS)生成引起脂質(zhì)過氧化、激活細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路等多種細(xì)胞效應(yīng)。MC-LR是蛋白磷酸酶2A(Proteinphosphata

4、se2A，PP2A)的強(qiáng)效抑制劑，對PP2A的特異性抑制可能是造成其毒作用機(jī)制錯綜復(fù)雜的原因之一。然而到目前為止，微囊藻毒素進(jìn)入肝細(xì)胞后，引發(fā)的可能與PP2A相關(guān)的細(xì)胞效應(yīng)以及各個細(xì)胞效應(yīng)間的聯(lián)系并不十分清楚。盡管目前蛋白質(zhì)組學(xué)大量篩選出了可能是微囊藻毒素抑制PP2A后的下游靶點蛋白，但是這些結(jié)果并不能動態(tài)和全面的反應(yīng)PP2A下游的細(xì)胞效應(yīng)以及各個效應(yīng)之間的聯(lián)系。以肝細(xì)胞為模型來探究微囊藻毒素致毒機(jī)理的研究也非常少。
　　 因此

5、，為進(jìn)一步探索以PP2A為主線的微囊藻毒素毒可能引起的細(xì)胞效應(yīng)以及各個細(xì)胞效應(yīng)間的聯(lián)系，在本研究中，我們應(yīng)用人肝細(xì)胞系HL7702為模型，以蛋白磷酸酶PP2A為線索，探索MC-LR抑制PP2A活性后可能引起的下游靶蛋白變化和肝細(xì)胞內(nèi)的MC-LR應(yīng)激效應(yīng)，并試圖構(gòu)建以PP2A為中心的肝細(xì)胞暴露于MC-LR后的細(xì)胞內(nèi)應(yīng)答通路，為微囊藻毒素的致毒機(jī)理提供更多的依據(jù)。
　　 本研究的檢測內(nèi)容主要包括兩個部分。第一部分檢測MC-LR引起的

6、肝細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞效應(yīng)，主要內(nèi)容包括：檢測MC-LR對蛋白磷酸酶PP2A活性的影響；MC-LR對MAPK家族蛋白的影響；MC-LR對細(xì)胞骨架以及一些骨架相關(guān)蛋白的影響；MC-LR對細(xì)胞周期的影響；MC-LR對細(xì)胞存活力的影響。第二部分檢測MC-LR引起的細(xì)胞效應(yīng)之間的聯(lián)系，主要包括：應(yīng)用PP2A激活劑D-erythro-Sphingosine(DES)后對PP2A下游影響的驗證；應(yīng)用MAPK激酶抑制劑檢測MAPK對下游靶點的調(diào)控。
　　

7、 第一部分主要結(jié)果：
　　 1.MC-LR暴露于HL7702細(xì)胞后，與PP2A催化亞基結(jié)合，抑制PP2A活性。
　　 2.MC-LR暴露于HL7702細(xì)胞后，引起MAPK家族p38MAPK，ERK和JNK蛋白磷酸化水平升高；并且ERK，JNK的磷酸化修飾早于p38MAPK。
　　 3.MC-LR染毒HL7702細(xì)胞引起乙?；⒐艿鞍妆磉_(dá)降低；引起酪氨酸化微管蛋白在細(xì)胞內(nèi)的排列變化；引起微絲和徼管在細(xì)胞內(nèi)的排列改

8、變。
　　 4.MC-LR染毒HL7702細(xì)胞引起Tau，HSP27，VASP蛋白磷酸化表達(dá)增加；影響Tau，HSP27在細(xì)胞骨架部分的分布。
　　 5.MC-LR染毒HL7702細(xì)胞引起細(xì)胞周期相關(guān)蛋白p53，cdc2，cdc25c的磷酸化修飾發(fā)生改變，但是并沒有引起細(xì)胞周期改變。
　　 6.在本研究條件下，MC-LR染毒HL7702細(xì)胞并沒有影響細(xì)胞存活力。
　　 第二部分主要結(jié)果：
　　 1

9、.應(yīng)用PP2A激動劑DES作用于細(xì)胞后，DES能夠減弱MC-LR引起的Tau蛋白，HSP27的磷酸化升高效應(yīng)。DES能夠降低細(xì)胞周期相關(guān)的p53，cdc25c，cdc2的磷酸化水平。
　　 2.應(yīng)用免疫熒光技術(shù)分別檢測B55α、B56α與細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的共定位，結(jié)果在MC-LR處理細(xì)胞組B56α和磷酸化cdc25c出現(xiàn)共定位，并且共定位更多的集中在細(xì)胞膜下皮質(zhì)層的胞漿中。
　　 3.分別應(yīng)用MAPK抑制劑后，驗證HSP

10、27，Tau的磷酸化水平改變，結(jié)果顯示：p38MAPK和JNK抑制劑能夠減低HSP27的磷酸化修飾水平；p38MAPK抑制劑能夠減低Tau的磷酸化水平。
　　 主要結(jié)論：
　　 1.MC-LR染毒HL7702細(xì)胞后，能夠與PP2A催化亞基結(jié)合，抑制PP2A的活性。
　　 2.MC-LR染毒能夠激活MAPK三條經(jīng)典的信號通路p38MAPK通路，ERK通路，JNK通路；但是p38MAPK通路對MC-LR的反應(yīng)敏感性低

11、于ERK和JNK通路。
　　 3.MC-LR通過影響乙?；⒐艿鞍?、酪氨酸化微管、F-actin和微管重新排列而引起細(xì)胞骨架的穩(wěn)定性下降；PP2A被抑制激活p38MAPK引起下游Tau的磷酸化增加，從而影響Tau穩(wěn)定微管的功能；p38MAPK和JNK激酶調(diào)節(jié)下游HSP27蛋白，使HSP27蛋白磷酸化表達(dá)增加來抵抗骨架的損傷。
　　 4.MC-LR能夠通過PP2A影響細(xì)胞周期相關(guān)的蛋白p53，cdc25，cdc2的磷酸化水