1、結(jié)核?。═uberculosis，TB）是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacteriumtuberculosis，MTB）所致的、以呼吸系統(tǒng)感染為主的傳染病。近年來(lái)，由于卡介苗（BCG）保護(hù)性的不完善、耐藥MTB菌株的出現(xiàn)、艾滋病的流行以及人口流動(dòng)等因素的增加，使得TB的發(fā)病率呈日益上升的趨勢(shì)，再次成為危害人類(lèi)健康的世界性疾病。BCG是目前預(yù)防TB的唯一疫苗，但其不能有效預(yù)防成人TB，因此，積極研究TB的致病及免疫機(jī)制，對(duì)于開(kāi)發(fā)更為有效的診

2、斷、預(yù)防和治療TB的新技術(shù)具有重要意義。
　　藤黃微球菌（M.luteus）中的復(fù)活促進(jìn)因子（Resuscitation-promotingfactor，Rpf）是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌生長(zhǎng)因子，它具有促進(jìn)休眠菌的復(fù)蘇以及促進(jìn)細(xì)菌快速生長(zhǎng)的作用。序列對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，在其它的一些革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌如MTB、麻風(fēng)分枝桿菌、藍(lán)色鏈霉菌、谷氨酸棒桿菌等中也存在30多個(gè)與Rpf同源的蛋白。研究發(fā)現(xiàn)MTB基因組可編碼5種Rpf樣蛋白，分別為Rv0867

3、C（RpfA）、Rv1009（RpfB）、Rv1884C（RpfC）、Rv2389C（RpfD）和Rv2450C（RpfE），推測(cè)這些蛋白也具有促進(jìn)MTB快速生長(zhǎng)的作用。此外，這些蛋白均具有Rpf樣結(jié)構(gòu)域，即高度保守的70aa殘基，該保守區(qū)域?qū)pf的復(fù)蘇功能是至關(guān)重要的，單獨(dú)的Rpf結(jié)構(gòu)域具有與Rpf蛋白一致的生物學(xué)功能。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，Rpf結(jié)構(gòu)域中都有一個(gè)高度保守的谷氨酸殘基（glu54），為Rpf活性所必需，與溶菌酶催化活性相

4、符。
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br>　　利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)并純化出M.luteusRpf結(jié)構(gòu)域及其突變體蛋白，并進(jìn)一步研究其生物學(xué)活性。
　　實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果：
　　1.Rpf結(jié)構(gòu)域及其突變體蛋白的表達(dá)及純化
　　采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）從M.luteus基因組中擴(kuò)增出Rpf結(jié)構(gòu)域及其E54A和E54K兩種突變體基因，用限制性?xún)?nèi)切酶消化后克隆入pMD-18T載體中，經(jīng)測(cè)序證實(shí)，與GenBank公布的序列完全相同，

5、突變位點(diǎn)與設(shè)定一致。將測(cè)序正確的基因分別亞克隆到pGEX-4T-1表達(dá)載體中，酶切鑒定陽(yáng)性重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE分析表明成功地表達(dá)了Rpf結(jié)構(gòu)域及其突變體融合蛋白，用Rpf結(jié)構(gòu)域單克隆抗體（mAb）進(jìn)行Western-blot分析證實(shí)，其大小為32kD，與預(yù)計(jì)的融合蛋白大小相符。用GS-4B親和色譜柱純化獲得了目的蛋白。
　　2.Rpf結(jié)構(gòu)域及其突變體融合蛋白生物學(xué)活性的檢測(cè)
　　

6、將恥垢分枝桿菌（Mycobacteriumsmegmatis，M.S）休眠菌以1：150的比例稀釋。把各種融合蛋白按照不同的濃度加入到M.S休眠菌中，并分別用相應(yīng)的抗體進(jìn)行干預(yù)。37℃振蕩培養(yǎng)，每4h取少量培養(yǎng)液測(cè)A600nm值，根據(jù)測(cè)定結(jié)果繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)圖。結(jié)果表明：Rpf結(jié)構(gòu)域蛋白對(duì)M.S具有促進(jìn)復(fù)蘇和促生長(zhǎng)的作用，使M.S的培養(yǎng)周期縮短。而且Rpf結(jié)構(gòu)域蛋白具有和Rpf蛋白相同的生物學(xué)活性。E54K突變后的Rpf蛋白對(duì)于M.S的生長(zhǎng)

7、有一定的抑制作用，而E54A無(wú)明顯的抑制生長(zhǎng)作用。
　　結(jié)論：
　　獲得了Rpf結(jié)構(gòu)域及其兩種突變體蛋白E54K和E54A，Rpf結(jié)構(gòu)域蛋白與完整的Rpf蛋白一樣對(duì)M.S具有一定的復(fù)蘇和促生長(zhǎng)作用；而加入Rpf及Rpf結(jié)構(gòu)域抗體后，其作用被抵消，使M.S維持正常生長(zhǎng)。E54K突變體對(duì)于休眠的M.S的生長(zhǎng)有一定的抑制作用。E54A對(duì)于休眠的M.S無(wú)明顯的抑制作用。這些結(jié)果為研究Rpf結(jié)構(gòu)域突變體在抑制M.luteus的生長(zhǎng)，進(jìn)