1、目的:建立斑馬魚 gata1-g6pdM1315-1443-EGFP轉(zhuǎn)基因品系。實現(xiàn)目的突變型 g6pd基因在gata-1啟動子的啟動下特異性在斑馬魚紅細胞中表達，并標(biāo)記增強型綠色熒光蛋白（EnhancedGreen Fluorescent Portein，EGFP）。進而實現(xiàn)突變型g6pd在斑馬魚體內(nèi)表達，實現(xiàn)顯性負效應(yīng)，在表達突變型G6PD蛋白的同時，影響正常G6PD的表達，致使G6PD活性減低，擬建立葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥（

2、gluocose-6-phosphate dehydrogenase deficiency,G6PDD）的斑馬魚生物模型，為進一步研究G6PD缺乏癥發(fā)病的分子機制及大規(guī)模藥物篩選提供實驗基礎(chǔ)。
　　方法:構(gòu)建gata1-g6pdM1315-1443-EGFP-PBSK-IsceI重組質(zhì)粒，利用顯微注射技術(shù)將本課題組已構(gòu)建完成的gata1-g6pdM1315-1443-EGFP-PBSK-IsceI質(zhì)粒與IsceI酶共注射入 tü

3、ebingen野生型品系斑馬魚單細胞期胚胎中，使 gata1-g6pdM1315-1443-EGFP-PBSK-IsceI質(zhì)粒導(dǎo)入斑馬魚體內(nèi)。通過觀察注射 gata1-g6pdM1315-1443-EGFP-PBSK-IsceI質(zhì)粒后的斑馬魚胚胎中綠色熒光蛋白表達表達情況，初步篩選出血液循環(huán)中可以表達綠色熒光蛋白的胚胎飼養(yǎng)擬作為F0代。飼養(yǎng)F0代至繁殖期后，將每一條F0代魚與tüebingen野生型品系斑馬魚交配，同樣以觀察綠色熒光蛋白

4、表達的方法初步篩選出可以血液循環(huán)中可以表達綠色熒光蛋白的胚胎作為F1代。并利用基因組PCR法（genomic PCR）、全胚胎原位雜交（WISH）、蛋白印跡法（western blot）分別從DNA、mRNA、蛋白質(zhì)水平上鑒定 F1代 Tg:gata1- g6pdM1315-1443-EGFP轉(zhuǎn)基因系斑馬魚是否表達目的轉(zhuǎn)基因gata1-g6pdM1315-1443-EGFP,并以地高辛標(biāo)記的反義band3 RNA作為探針，利用全胚胎原位

5、雜交初步檢測Tg:gata1- g6pdM1315-1443-EGFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚中紅細胞膜蛋白 Band3在 mRNAs水平上的表達情況，間接反映目的轉(zhuǎn)基因系斑馬魚中紅細胞膜的穩(wěn)定性情況。
　　結(jié)果：將目的gata1-g6pdM1315-1443-EGFP-PBSK-IsceI質(zhì)粒導(dǎo)入斑馬魚單細胞胚胎中，并在斑馬魚血液循環(huán)中觀察到綠色熒光蛋白的表達，以此篩選得到擬F0代，并獲得血液循環(huán)中表達綠色熒光蛋白的斑馬魚作為F1代，利用基

6、因組PCR鑒定F1代斑馬魚基因組中成功插入g6pdM1315-1443目的基因、全胚胎原位雜交鑒定F1代斑馬魚中有EGFP的mRNA表達信號、Western Blot鑒定得到F1代斑馬魚中存在g6pdM1315-1443-EGFP融合蛋白質(zhì)的表達。從而證明目的質(zhì)粒 gata1-g6pdM1315-1443-EGFP-PBSK-IsceI成功整合入斑馬魚基因組并表達，并成功轉(zhuǎn)錄RNA表達目的蛋白質(zhì)，鑒定出F1代轉(zhuǎn)基因系斑馬魚的同時，篩選出

7、F0代轉(zhuǎn)基因系斑馬魚。并初步檢測出 F1代 Tg:gata1- g6pdM1315-1443-EGFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚中 band3 mRNA的表達相比野生型tüebingen斑馬魚和gata1-EGFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚表達信號降低。
　　結(jié)論：成功建立斑馬魚 Tg:gata1- g6pdM1315-1443-EGFP轉(zhuǎn)基因品系，使得突變型g6pdM1315-1443基因在 gata-1的啟動下在斑馬魚紅細胞中特定表達，在表達斑馬魚異常