1、[目的]
　　1.研究空白血清不同濃度及補腎活血方藥黃芪三仙湯，補腎方藥金匱腎氣丸各劑量含藥血清對體外培養(yǎng)大鼠成骨細胞增殖的影響，確定培養(yǎng)成骨細胞的最佳劑量含藥血清濃度。
　　2.研究補腎活血方藥黃芪三仙湯含藥血清、補腎方藥金匱腎氣丸含藥血清及空白血清對成骨細胞蛋白質(zhì)組表達差異的影響。
　　3.通過差異蛋白點的質(zhì)譜鑒定，初步了解他們的性質(zhì)、功能。
　　[方法]
　　1.采用混合酶消化法體外分離細胞，通過形態(tài)

2、學標準和細胞堿性磷酸酶染色鑒定細胞;制備實驗組補腎活血方藥黃芪三仙湯不同劑量的含藥血清，補腎方藥金匱腎氣丸不同劑量的含藥血清及空白組血清，并用各組血清對體外培養(yǎng)成骨細胞進行干預實驗，采用MTT法觀察各空白血清濃度及各劑量含藥血清濃度對成骨細胞增殖的影響。
　　2.應(yīng)用雙向凝膠電泳（two-dimensional gel electrophoresis簡稱2-DE）方法，研究黃芪三仙湯含藥血清，金匱腎氣丸含藥血清及空白血清對成骨細胞

3、蛋白質(zhì)組的影響，并在重復實驗中進行實驗條件的優(yōu)化與改良;得到的2-DE圖像用Image-Master2D Platinum軟件進行統(tǒng)計學分析，選取Overlap Ratio絕對值≥2點為差異蛋白點。
　　3.選取10個有明顯表達差異的蛋白質(zhì)點進行膠內(nèi)胰蛋白酶解，再使用MALDI-TOF/TOF-MS質(zhì)譜儀一一分析，將質(zhì)譜分析得出的指紋圖譜經(jīng)過數(shù)據(jù)庫檢索分析后，識別鑒定各個蛋白質(zhì)。
　　[結(jié)果]
　　1.采用混合酶消化法

4、分離培養(yǎng)出的細胞，通過形態(tài)學標準和細胞堿性磷酸酶呈陽性染色確定培養(yǎng)的細胞為成骨細胞。血清干預實驗中，10％、15％、20％空白血清組與5％空白血清組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);而15％、20％空白血清組與10％空白血清組比較差異亦有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。黃芪三仙湯等效劑量血清組及2倍等效劑量血清組與0.5倍等效劑量血清組和空白血清組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，2倍等效劑量血清組與等效劑量血清組亦比較差異有統(tǒng)計

5、學意義(P＜0.05)。金匱腎氣丸等效劑量血清組及2倍等效劑量血清組與0.5倍等效劑量血清組和空白血清組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，2倍等效劑量血清組與等效劑量血清組比較差異亦有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);而黃芪三仙湯與金匱腎氣丸各等劑量間比較差異無統(tǒng)計學意義。
　　2.采用優(yōu)化后的雙向凝膠電泳條件取得了重復性較好的2-DE圖譜;通過Image-Master2D Platinum圖像分析軟件對每組三塊膠圖譜分析后顯示:空

6、白對照組、黃芪三仙湯組、金匱腎氣丸組分別檢測到平均蛋白點數(shù)為(938±26)、(875±34)和(904±22)。經(jīng)分析空白對照組、黃芪三仙湯組、金匱腎氣丸組共有38個蛋白質(zhì)點具有明顯差異。其中與空白組比較，兩加藥組表達均上調(diào)的蛋白點有5個，表達均下調(diào)的蛋白點有2個;與空白組比較，金匱腎氣丸組表達沒有差異，而黃芪三仙湯組表達上調(diào)的蛋白點有2個，表達下調(diào)蛋白點有6個;與空白組比較，黃芪三仙湯組表達沒有差異，而金匱腎氣丸組表達上調(diào)的蛋白點有

7、16個，下調(diào)的蛋白點有7個。
　　3.送檢的10個差異蛋白點經(jīng)MALDI-TOF/TOF-MS分析獲得了10張肽質(zhì)量指紋圖譜和50張肽片段指紋圖譜，通過蛋白數(shù)據(jù)庫搜索匹配得分大于64分的有8個蛋白點，其中有4個蛋白點鑒定結(jié)果的等電點和分子量都與雙向電泳圖譜中的蛋白點位置比較一致，且匹配的物種也與實驗所用一致，是比較可信的鑒定結(jié)果。
　　[結(jié)論]
　　1.采用混合酶多次消化法可以獲得足夠數(shù)量和純度的成骨細胞，并且符合成骨

8、細胞形態(tài)及功能特點，而且此法簡單、實用，適于做體外實驗研究模型。黃芪三仙湯、金匱腎氣丸等效劑量和2倍等效劑量的10％含藥血清濃度對成骨細胞增殖有明顯促進作用。
　　2.通過蛋白質(zhì)雙向凝膠技術(shù)結(jié)合質(zhì)譜兼容的硝酸銀染色可以得到分辨率較高，重復性較好的各實驗組成骨細胞的蛋白質(zhì)組圖譜，為進一步進行質(zhì)譜鑒定奠定了良好的基礎(chǔ)。
　　3.10個差異蛋白點質(zhì)譜鑒定出了4個比較可信的蛋白，分別是:抑制素(prohibitin)、轉(zhuǎn)錄延伸因子B