1、第一章SV40永生化成骨細胞hFOB1.19成骨性、成瘤性驗證以及試驗體系的建立。 目的：骨肉瘤作為最常見的惡性骨腫瘤，仍缺乏特異性的蛋白分子標志，篩選骨肉瘤特異性蛋白有利于發(fā)現新的治療靶點和開展腫瘤早期診斷。因此，本實驗擬采用人骨肉瘤細胞系和SV40永生化的成骨細胞系hFOB1.19作對照，篩選骨肉瘤差異表達蛋白。首先對SV40永生化的hFOB1.19成骨和成瘤性進行驗證，建立試驗對照體系。 方法：常規(guī)培養(yǎng)骨肉瘤細胞U

2、2-OS、IOR/OS9、SaOS-2和成骨細胞hFOB1.19。待成骨細胞hFOB1.19生長至融合時，采用鈣鈷法和α-萘基磷酸染色，顯示hFOB1.19細胞堿性磷酸酶(ALP)表達，取3張玻片，每張玻片隨機計數200個細胞，計算陽性細胞的比率。長期培養(yǎng)的成骨細胞觀察其鈣化結節(jié)的形成，以茜素紅染色顯示。將成骨細胞hFOB1.19和骨肉瘤細胞IOR/OS9分別接種于5只BALB/c-nu/nu裸鼠的頸部和腹股溝皮下，于SPF環(huán)境中飼養(yǎng)8

3、周，觀察裸鼠皮下成瘤情況，取皮下瘤測量體積和重量，腫瘤組織行常規(guī)切片HE染色。 結果：SV4.0永生化的成骨細胞hFOB1.19呈短梭形、類梭形，多角形，較飽滿，胞漿豐富，排列整齊有序，具有典型的成骨細胞形態(tài)。ALP的鈣鈷法染色顯示陽性細胞胞漿內呈灰黑色、棕黑色顆粒，α-萘基磷酸法染色陽性細胞呈淺褐色、褐色。陽性細胞多為多角形、細胞體積大，多角形細胞聚集處ALP染色強陽性。計數3張玻片ALP陽性細胞為176±8，陽性率為88.0

4、﹪。hFOB1.19長期培養(yǎng)(20天)細胞呈復層生長，形成礦化結節(jié)，鈣結節(jié)茜素紅染色呈橘紅色，圓形，邊界清晰，計數六孔板之6孔礦化結節(jié)數量，hFOB1.19成骨細胞形成鈣化結節(jié)的數量為110±11。裸鼠成瘤試驗顯示，5例骨肉瘤細胞IOR/OS9在裸鼠體內全部成瘤，成瘤率100﹪(5/5)，并經HE病理切片證實，而hFOB1.19在裸鼠體內沒有成瘤。 結論：SV40永生化的成骨細胞系hFOB1.19具有正常成骨細胞的典型特征，均一

5、性好，增殖快，短期內可獲得大量的成骨細胞。hFOB1.19無成瘤性，可以作為骨肉瘤細胞的正常對照，進行比較蛋白質組學研究。 第二章人骨肉瘤細胞株和SV40永生化成骨細胞株hFoB1.19比較蛋白質組學研究。 目的：采用SV40永生化的成骨細胞株hFOB1.19作對照，運用比較蛋白質組學技術，篩選、鑒定3株人骨肉瘤細胞株U2-OS、IOR/OS9、SaOS-2差異表達的蛋白質，為發(fā)現新的治療靶點和開展早期診斷提供一些路徑。

6、 方法：分別提取3株人骨肉瘤細胞U2-OS、IOR/OS9、SaOS-2和SV40永生化成骨細胞hFOB1.19的細胞總蛋白，經蛋白純化和定量后，進行2-DE雙向凝膠電泳分離蛋白點，經深紫(Deep purple)染色、掃描得到不同樣品的蛋白質組圖譜，每個樣品重復3次獨立試驗以保證試驗的重復性。經ImageMaster V5.0圖象分析軟件分析，每組腫瘤細胞分別和hFOB1.19比較，以差異比率大于2.0作為有意義的統(tǒng)計學標準(

7、p<0.05，Student's t-test)，尋找骨肉瘤差異表達的蛋白質點。 并運用基質輔助的激光電離飛行時間(MALDI-TOF)質譜儀，對差異蛋白點進行質譜鑒定，獲得各蛋白點的肽質量指紋譜(peptide mass fingerpriming，PMF)，經Mascot在線數據庫檢索，鑒定骨肉瘤細胞差異表達的蛋白質。 結果：經ImageMaster V5.0圖象分析軟件分析，差異大于2.0倍的蛋白質點結果為：U2-

8、OS和hFOB1.19相比有32個差異蛋白點，其中U2-OS有10個蛋白點上調，22個蛋白點下調；IOR/OS9和hFOB1.19相比有32個差異蛋白點，其中IOR/OS9有8個蛋白點上調，24個蛋白點下調；SaOS-2和hFOB1.19相比34個差異蛋白點，SaOS-2有上調蛋白點10個，下調蛋白點24個；3組細胞系間共有40個相同的蛋白斑點，3組間共計有58個差異蛋白點。 運用質譜技術，骨肉瘤細胞和正常成骨細胞之間共有26個

9、差異蛋白獲得成功鑒定，其中骨肉瘤細胞有9個蛋白上調，17個蛋白下調。熱休克蛋白90ATPase的激動劑(activator of 90 kDa shock protein ATPase homolog 1，AHA1)在全部3組骨肉瘤細胞中高表達，AHA1在骨肉瘤細胞U2-OS、IOR/OS9、SaOS-2中上調比率分別為23.8倍、24.1倍、12.4倍；Stomatin like protein 2(SLP-2)在2組骨肉瘤細胞中高表

10、達，分別在U2-OS和IOR/OS9中上調7.8倍和10.4倍，SLP-2在SaOS-2中沒有明顯升高。3組骨肉瘤全部下調的蛋白為谷胱甘肽轉移酶omega-1(Glutathione transferase omega-1)、52 kDa Ro protein、乙酰葡糖胺磷酸變位酶(Phosphoacetylglucosamine mutase)、干擾素誘導GTP結合蛋白Mx1(Interferon-induced GTP-bindin

11、g protein Mx 1.IFI-78K)。 結論：SV40永生化的成骨細胞hFOB1.19和3株骨肉瘤細胞U2-OS、IOR/OS9、SaOS-2蛋白質組存在差異，骨肉瘤細胞差異表達的蛋白質特別是9個上調蛋白，可作為篩選骨肉瘤特異蛋白的候選靶點。 第三章部分差異蛋白的Western blot驗證。 目的：鑒于AHA1在3株骨肉瘤細胞、SLP-2在2株骨肉瘤細胞中表達明顯升高，選取二者進行Western bl

12、ot驗證。 方法：分別用3株骨肉瘤細胞U2-OS、IOR/OS9、SaOS-2和SV40永生化的成骨細胞hFOB1.19細胞總蛋白，經10﹪十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離，轉膜，用AHA1和SLP-2單克隆抗體進行免疫印跡，比較在各組細胞中的表達。試驗重復三次以保證可靠性。 結果：與對照組hFOB1.19相比，AHA1在SaOS-2、 IOR/OS9、U2-OS骨肉瘤細胞組表達顯著上調。SLP