1、乙型肝炎病毒(HBV)常引起持續(xù)性感染，導(dǎo)致慢性肝炎，并引起肝硬化和肝細(xì)胞癌。HBV感染引起慢性化的機(jī)制尚不清楚，但病毒編碼的蛋白對機(jī)體免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)作用是其中之一，隨著固有免疫應(yīng)答的深入研究，HBV對固有免疫的調(diào)節(jié)作用也日益受到重視，同時通過誘導(dǎo)固有免疫應(yīng)答有望在慢性HBV的治療中發(fā)揮一定的作用。通過激活TBKl，活化的TBKl能誘導(dǎo)IRF3二聚化并轉(zhuǎn)入核內(nèi)，從而增強(qiáng)Ⅰ型干擾素的表達(dá)，調(diào)節(jié)機(jī)體的固有免疫應(yīng)答，并影響適應(yīng)性免疫，有可能在

2、慢性病毒感染如HBV和HCV感染的治療中發(fā)揮一定的作用。
　　 目的：以肝癌細(xì)胞株HepG2和整合HBV的肝癌細(xì)胞株HepG2.2.15為細(xì)胞模型，研究dsRNA誘導(dǎo)肝細(xì)胞表達(dá)IFN-β的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)特點；HBcAg真核表達(dá)質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染及其重組蛋白處理HepG2細(xì)胞，觀察HBcAg對dsRNA誘導(dǎo)肝細(xì)胞表達(dá)IFN-p的調(diào)節(jié)作用；TBK1真核表達(dá)質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞和HepG2.2.15細(xì)胞，觀察TBK1的抗HBV作用。本研究以

3、期為闡明肝細(xì)胞內(nèi)抗病毒免疫機(jī)制和HBV慢性感染的分子機(jī)制，同時也為研制新型慢性乙肝治療藥物提供實驗和理論依據(jù)。
　　 方法：⑴pcDNA3-HBc質(zhì)粒的構(gòu)建：以HBV ayw亞型全長質(zhì)粒pCP10為模板，PCR擴(kuò)增編碼HBcAg的基因，將其插入真核表達(dá)質(zhì)粒載體pcDNA3。⑵poly I:C刺激HepG2細(xì)胞誘導(dǎo)IFN-β的表達(dá)：取對數(shù)生長期HepG2細(xì)胞，polyI:C以O(shè)μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg

4、/ml刺激細(xì)胞12h、24h，刺激后提取細(xì)胞總RNA，熒光定量PCR檢測IFN-p mRNA表達(dá)。⑶pcDNA3-HBc轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞對polyI:C誘導(dǎo)表達(dá)IFN-β的作用：取對數(shù)生長期HepG2細(xì)胞，將質(zhì)粒pcDNA3-HBc以1.2μg轉(zhuǎn)染細(xì)胞，培養(yǎng)24h后，100μg/ml polyI:C刺激細(xì)胞24h，定量PCR檢測IFN-β mRNA表達(dá)；ELISA檢測細(xì)胞上清中IFN-β濃度。⑷HBcAg重組蛋白對polyI:C誘導(dǎo)肝

5、細(xì)胞表達(dá)IFN-p的調(diào)節(jié)作用：取對數(shù)生長期HepG2細(xì)胞，HBcAg重組蛋白以O(shè)μg/ml、10μg/ml處理細(xì)胞48h后，100μg/ml polyI:C刺激細(xì)胞24h。定量PCR檢測IFN-β mRNA表達(dá)；ELISA檢測細(xì)胞上清中IFN-β濃度。⑸pcDNA3-hTBK1質(zhì)粒的構(gòu)建：以hTBK1 DNA為模板，PCR擴(kuò)增目的基因，將其插入真核表達(dá)質(zhì)粒載體pcDNA3。⑹pcDNA3-hTBK1轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞對poly I:C誘導(dǎo)

6、表達(dá)IFN-β的作用：取對數(shù)生長期Hela細(xì)胞，將質(zhì)粒pcDNA3- hTBK1以0μg、0.6μg.1.2μg、1.8μg轉(zhuǎn)染細(xì)胞，培養(yǎng)24h后，100μg/ml poly I:C刺激細(xì)胞24h，定量PCR檢測IFN-β mRNA表達(dá)；ELISA檢測細(xì)胞上清中IFN-β濃度。⑺pcDNA3-hTBK1轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞對poly I:C誘導(dǎo)表達(dá)IFN-β的作用：取對數(shù)生長期HepG2細(xì)胞，將質(zhì)粒pcDNA3-hTBK1以不同濃度轉(zhuǎn)染細(xì)

7、胞，培養(yǎng)24h后，100μg/ml poly I:C刺激細(xì)胞24h，定量PCR檢測IFN-β mRNA表達(dá)；ELISA檢測細(xì)胞上清中IFN-β濃度。⑻poly I:C刺激HepG2.2.15細(xì)胞誘導(dǎo)IFN-β的表達(dá)：取對數(shù)生長期HepG2.2.15細(xì)胞，poly I:C以0μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml刺激細(xì)胞24h，定量PCR檢測IFN-β的表達(dá)；ELISA檢測細(xì)胞上清中IFN-β濃度；時間分辨熒光免疫測

8、定技術(shù)( TRFIA)檢測細(xì)胞上清中HBsAg和HBeAg含量；定量PCR檢測細(xì)胞上清和細(xì)胞中HBV DNA拷貝數(shù)。⑼pcDNA3-hTBKI轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞對poly I:C誘導(dǎo)抗病毒作用的調(diào)節(jié)作用：取對數(shù)生長期HepG2.2.15細(xì)胞，將質(zhì)粒pcDNA3-hTBK1以1.8μg轉(zhuǎn)染細(xì)胞，培養(yǎng)24h后，poly I:C以0μg/ml、25μg/ml、50yg/ml、100μg/ml刺激細(xì)胞24h，定量PCR檢測IFN-β

9、mRNA表達(dá)；ELISA檢測細(xì)胞上清中IFN-β濃度；同時檢測細(xì)胞上清中HBsAg和HBeAg含量及上清和細(xì)胞中HBV DNA拷貝數(shù)。
　　 結(jié)果：①經(jīng)EcoR I和BamH I酶切電泳鑒定，以及重組體插入片段的DNA序列測定，證實成功地構(gòu)建了含C基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-HBc。②poly I:C刺激HepG2細(xì)胞誘導(dǎo)IFN-β表達(dá)：polyI:C刺激細(xì)胞12h，與對照組相比，刺激組IFN-β表達(dá)顯著增高(P<0.05)

10、，并隨濃度增高而表達(dá)升高，各刺激組有顯著差異(P<0.05)，同時poly I:C刺激細(xì)胞24h較刺激12h組IFN-β表達(dá)顯著增高(P<0.05)。③pcDNA3-HBc轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞對polyI:C誘導(dǎo)表達(dá)IFN-β的作用：與對照組相比，1.2μg轉(zhuǎn)染組IFN-β表達(dá)有所降低，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)；與對照組相比，細(xì)胞上清中IFN-β濃度顯著減少(P<0.05)。④HBcAg重組蛋白對poly I:C誘導(dǎo)肝細(xì)胞表達(dá)IFN

11、-p的調(diào)節(jié)作用：與對照組相比，HBcAg重組蛋白處理組IFN-β表達(dá)和濃度均顯著降低(P<0.05)。⑤經(jīng)Xba I和BamH I酶切電泳鑒定，以及重組體插入片段的DNA序列測定，證實成功地構(gòu)建了含hTBK1的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-hTBK1。⑥pcDNA3-hTBKI轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞對poly I:C誘導(dǎo)表達(dá)IFN-β的作用：與對照組和其他轉(zhuǎn)染組相比，18μg轉(zhuǎn)染組IFN-β表達(dá)顯著增加；與對照組和0.6μg轉(zhuǎn)染組相比，1.2μg

12、轉(zhuǎn)染組IFN-β表達(dá)也顯著增加(P<0.05)；與對照組相比，各轉(zhuǎn)染組IFN-β濃度均有增加，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。⑦pcDNA3-hTBK1轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞對poly I:C誘導(dǎo)表達(dá)IFN-β的作用：隨著轉(zhuǎn)染量的增加，IFN-β表達(dá)顯著增加，與對照組和0.6μg轉(zhuǎn)染組相比，1.2μg、1.8μg轉(zhuǎn)染組IFN-β表達(dá)顯著增加，不同濃度轉(zhuǎn)染組有顯著差異(P<0.05)；與對照組相比，各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞上清IFN-β濃度均無顯著差異(

13、P>0.05)。⑧poly I:C刺激HepG2.2.15細(xì)胞誘導(dǎo)IFN-p的表達(dá)：與對照組相比，不同濃度刺激組IFN-p表達(dá)無顯著差異(P>0.05)。隨著poly I:C刺激濃度的增加，上清中IFN-β濃度呈梯度顯著增加，不同濃度刺激組也存在顯著差異(P<0.05)。與對照組相比，不同濃度刺激組上清中HBsAg和HBeAg含量、及上清和細(xì)胞中HBV DNA拷貝數(shù)均無顯著差異(P>0.05)。⑨pcDNA3-hTBKI轉(zhuǎn)染HepG2.

14、2.15細(xì)胞對poly I:C誘導(dǎo)抗病毒作用的調(diào)節(jié)作用：與對照組和25μg/ml刺激組相比，100μg/ml poly I:C刺激組IFN-β表達(dá)顯著增加(P<0.05)；與對照組相比，各刺激組上清中IFN-β濃度均無顯著差異(P>0.05)。與對照組相比，50μg/ml和100μg/ml poly I:C刺激組HBsAg表達(dá)顯著降低(P<0.05)，不同濃度刺激組HBeAg表達(dá)無顯著差異(P>0.05)；與對照組相比，不同濃度刺激組上

15、清HBV DNA拷貝數(shù)均有顯著下降(P<0.05)，各組則無顯著差異(P>0.05)；不同濃度刺激組細(xì)胞HBV DNA拷貝數(shù)無顯著差異(P>0.05)。
　　 結(jié)論：poly I:C刺激HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞可誘導(dǎo)IFN-p表達(dá)，提示肝細(xì)胞可能在抗病毒固有性免疫應(yīng)答中起重要的作用。HBcAg真核表達(dá)質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染及其重組蛋白處理可抑制poly I:C誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞表達(dá)IFN-p，提示HBcAg具有拮抗機(jī)體抗病毒固

16、有免疫的作用。hTBK1真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞和HepG2.2.15細(xì)胞，可促進(jìn)poly I:C誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞和HepG2.2.15細(xì)胞表達(dá)IFN-p，同時一定濃度的hTBKI轉(zhuǎn)染可有效降低HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg及HBV DNA拷貝數(shù)，提示TBK1可能通過增強(qiáng)固有免疫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，增加細(xì)胞因子如Ⅰ型干擾素(IFN-β)的表達(dá)，進(jìn)而對HBV起到一定抑制作用。結(jié)果提示，病毒感染時肝細(xì)胞可產(chǎn)生一定的固有免疫應(yīng)答，發(fā)