1、研究背景：隨著生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的變化，人們患有心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)越來(lái)越大。許多情況下，病人需要通過(guò)血管的置換手術(shù)來(lái)提高生活質(zhì)量甚至是挽救生命。患者自身其它部位的血管被認(rèn)為是置換手術(shù)中的最好的材料，但大多數(shù)患者并不具備合適的可移植血管，尤其是實(shí)施多次手術(shù)的患者：另外這個(gè)手術(shù)的實(shí)施極易對(duì)患者會(huì)造成新的創(chuàng)傷。于是人們便開始尋找新型的血管替代材料，組織工程概念的提出為構(gòu)建組織工程血管提供了理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)方法。 制備脫細(xì)胞的異種血管

2、支架是目前組織工程血管研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)。同其它類型的組織工程血管相比，脫細(xì)胞異種血管支架具備更多優(yōu)點(diǎn)。與合成材料為基質(zhì)的組織工程血管相比，脫細(xì)胞異種血管支架具備更好的力學(xué)特征和生物相容性；與由胞外基質(zhì)蛋白(膠原蛋白或彈性蛋白)交聯(lián)而成的支架相比，它具備更好的三維結(jié)構(gòu)，更高的力學(xué)強(qiáng)度；同細(xì)胞自組裝的組織工程血管相比，它的制備更加簡(jiǎn)單，同時(shí)制備的周期更短。 脫細(xì)胞血管支架比起其它類型的組織工程血管具備很多優(yōu)點(diǎn)，而且在許多動(dòng)物試驗(yàn)中

3、也得到證實(shí)。但有很多實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，動(dòng)物的在體細(xì)胞募集能力比人類強(qiáng)很多，即使是生物相容性較差的合成材料植入動(dòng)物體內(nèi)也能獲得較好的細(xì)胞化，因此，脫細(xì)胞支架在人體內(nèi)能否取得同樣的效果還需要更多的臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)證明。事實(shí)上，脫細(xì)胞異種血管(或瓣膜)在人體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果卻并不理想，主要原因是炎癥反應(yīng)、鈣化以及支架材料的降解引起的并發(fā)癥。因此，脫細(xì)胞異種血管支架在人體內(nèi)的得到廣泛應(yīng)用之前，還有許多問(wèn)題需要得到解決。首先，如何控制脫細(xì)胞血管支架在體內(nèi)的

4、降解速度?通過(guò)對(duì)血管支架的膠原纖維進(jìn)行交聯(lián)處理，不僅可以減緩材料的降解過(guò)程，為組織的重建提供更充裕的時(shí)間，還可以有效降低免疫原性和鈣化的發(fā)生。其次，如何實(shí)現(xiàn)脫細(xì)胞異種血管的體外再細(xì)胞化?有充分的證據(jù)表明，血管內(nèi)皮細(xì)胞(EC)能夠有效防止血栓形成以及血管再狹窄所引起的血管阻塞，進(jìn)而提高組織工程血管移植的成功率。但作為血管的另一個(gè)重要細(xì)胞成分平滑肌細(xì)胞(SMC)的體外再細(xì)胞化研究卻很少，而兩種細(xì)胞成分在組織工程血管上的聯(lián)合細(xì)胞化的研究更是屈

5、指可數(shù)。SMC和EC之間的相互作用達(dá)到某種平衡被認(rèn)為是維持血管正常功能所必須的，用于研究SMC和EC之間相互關(guān)系的研究模型，不論是兩種細(xì)胞在PET膜兩側(cè)的共培養(yǎng)，或者在培養(yǎng)瓶中直接將EC種植于SMC細(xì)胞層上，都能證明SMC和EC之間能夠相互影響，這種影響不僅可以發(fā)生在形態(tài)學(xué)水平，還發(fā)生在分子生物學(xué)水平。因此，對(duì)脫細(xì)胞異種血管支架進(jìn)行SMC和EC的聯(lián)合種植，將有利于使兩種細(xì)胞的增殖、分化和功能更接近于在體環(huán)境，提高組織工程血管移植的成功率

6、。 本研究中，我們對(duì)犬主動(dòng)脈進(jìn)行一系列脫細(xì)胞處理，并對(duì)制備出的脫細(xì)胞血管支架進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，最后將在體外實(shí)現(xiàn)脫細(xì)胞血管支架的再細(xì)胞化，包括SMC和EC在支架材料上的單獨(dú)種植，以及EC在SMC上的聯(lián)合種植，擬制備出結(jié)構(gòu)和功能更加完整的組織工程血管支架。具體方法如下： 研究方法 1．犬動(dòng)脈的脫細(xì)胞處理我們實(shí)驗(yàn)室的前期研究結(jié)果表明，應(yīng)用多聚環(huán)氧化合物EX-810來(lái)處理主動(dòng)脈，除了能夠有效地交聯(lián)支架的膠原纖維外，還能部分去

7、除支架內(nèi)的細(xì)胞成分，同時(shí)保持胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)的完整，而且表現(xiàn)出極小的細(xì)胞毒性。但是，EX-810的主要作用是引起細(xì)胞的破裂，而殘留的細(xì)胞碎片可能會(huì)導(dǎo)致鈣化的發(fā)生。因此我們加入了低鹽滲透和超聲的方法，加速細(xì)胞的破碎，同時(shí)更有效去除細(xì)胞殘片。試驗(yàn)中應(yīng)用HE染色，DAPI染色技術(shù)來(lái)檢測(cè)脫細(xì)胞的效果。 2．脫細(xì)胞犬動(dòng)脈力學(xué)性能的評(píng)價(jià)除了上述對(duì)脫細(xì)胞犬動(dòng)脈進(jìn)行脫細(xì)胞效果檢測(cè)外，支架的力學(xué)性能評(píng)價(jià)也是判斷一種組織工程血管優(yōu)劣所必須的。力學(xué)性能

8、的檢測(cè)應(yīng)用INSTRON8874生物力學(xué)測(cè)試系統(tǒng)(Instron Co．，USA)行單軸拉伸試驗(yàn)，測(cè)定脫細(xì)胞犬動(dòng)脈支架的各種力學(xué)指標(biāo)，包括血管的最大荷載、最大荷載時(shí)的能量，最大荷載的伸長(zhǎng)長(zhǎng)度，以及最大荷載時(shí)的應(yīng)變率。 3．脫細(xì)胞犬動(dòng)脈的生物相容性檢測(cè)及體外再細(xì)胞化研究通過(guò)不同密度的SMC和EC在脫細(xì)胞犬動(dòng)脈支架表面的種植，以及EC在不同密度的SMC表面的種植。一方面對(duì)支架材料的細(xì)胞相容性進(jìn)行評(píng)價(jià)，另一方面確定在材料表面實(shí)現(xiàn)快速細(xì)

9、胞化所需要的細(xì)胞種植密度，以及如何實(shí)現(xiàn)EC和SMC在組織工程血管支架表面的直接聯(lián)合培養(yǎng)。用于主要的研究方法有掃描電鏡(SEM)、噻唑藍(lán)(MTT)和免疫組化染色。應(yīng)用Image-Pro Plus圖像處理軟件對(duì)SEM圖片進(jìn)行分析，計(jì)算細(xì)胞覆蓋率。 4．體外再細(xì)胞化的脫細(xì)胞犬動(dòng)脈抵抗流體切應(yīng)力的研究由于以合成材料為基質(zhì)的大口徑血管支架已經(jīng)在臨床上得到成功應(yīng)用，本研究主要針對(duì)于小口徑組織工程血管的制備。因此為了檢驗(yàn)種子細(xì)胞在支架材料表面

10、的粘附力，我們對(duì)細(xì)胞化的以脫細(xì)胞犬動(dòng)脈為基質(zhì)的組織工程血管支架施加5dyn/cm<'2>的流體切應(yīng)力，作用時(shí)間分別為2h和4h，通過(guò)SEM來(lái)觀察細(xì)胞的粘附能力；同時(shí)利用Image-Pro Plus圖像處理軟件對(duì)SEM圖片進(jìn)行分析，計(jì)算細(xì)胞覆蓋率，確定流體切應(yīng)力作用前后細(xì)胞在組織工程血管支架表面的覆蓋率變化情況。 結(jié)果： 1．HE染色和DAPI染色法均表明，EX-810能夠有效降低犬動(dòng)脈內(nèi)的細(xì)胞成分，但脫細(xì)胞的效果并不徹底

11、。去離子水和超聲在某種程度上能夠提高EX-810的脫細(xì)胞效果。三者共同作用下，幾乎所有的細(xì)胞成分都能除去，同時(shí)胞外基質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)保持完整。 2．經(jīng)過(guò)EX-810、去離子水和超聲處理的脫細(xì)胞犬動(dòng)脈，各種力學(xué)指標(biāo)的差異均無(wú)顯著差異，說(shuō)明脫細(xì)胞處理并沒(méi)有改變?nèi)畡?dòng)脈的力學(xué)性能。 3．種子細(xì)胞(SMC和EC)在以脫細(xì)胞犬動(dòng)脈為基質(zhì)的組織工程血管支架表面生長(zhǎng)良好。隨著接種密度的提高，種子細(xì)胞在材料上的排布更加有序；提高接種的密度有利

12、于在材料表面快速形成致密的細(xì)胞層。高密度接種EC能夠在不同接種密度的SMC上獲得致密的內(nèi)皮細(xì)胞層，但內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)、內(nèi)皮細(xì)胞的覆蓋率與SMC的接種密度有關(guān)。隨著底層SMC接種密度的增加，EC由典型的鋪路石狀變?yōu)殚L(zhǎng)梭形，細(xì)胞的立體感加強(qiáng)；在中等SMC接種密度條件下，EC在SMC上的覆蓋率最高。 4．對(duì)再細(xì)胞化的以脫細(xì)胞犬動(dòng)脈為基質(zhì)的組織工程血管支架施加5dyn/cm<'2>切應(yīng)力(2h和4h)，不論是EC單獨(dú)種植模型，還是EC在不

13、同密度SMC上的種植模型，致密的內(nèi)皮細(xì)胞層沒(méi)有被破壞，說(shuō)明我們制備以脫細(xì)胞犬動(dòng)脈為基質(zhì)的組織工程血管支架移植入體內(nèi)后，種植的EC仍然能夠發(fā)揮正常的生理功能。 結(jié)論 1．應(yīng)用EX-810、超聲和去離子水共同作用于犬動(dòng)脈，能夠有效去除血管內(nèi)的細(xì)胞成分，大大降低免疫原性。 2．以上脫細(xì)胞的方法能夠有效保持血管本身的力學(xué)性能。 3．制備出的以脫細(xì)胞犬動(dòng)脈為基質(zhì)的組織工程血管支架具有良好的細(xì)胞相容性，能夠在體外實(shí)現(xiàn)