1、背景與目的:
　　關(guān)節(jié)軟骨損傷是臨床上常見(jiàn)的疾病，常因創(chuàng)傷、退變、炎癥、腫瘤等原因?qū)е?。軟骨組織是一種高分化組織，一旦損傷，將難以自行修復(fù)，隨時(shí)間推移將繼續(xù)惡化，給患者帶來(lái)關(guān)節(jié)功能的影響，降低患者的生活質(zhì)量。因此，關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)成為骨科領(lǐng)域的重點(diǎn)和難點(diǎn)。目前，各種治療手段如鉆孔術(shù)、關(guān)節(jié)成形術(shù)、微骨折、自體或異體組織（骨膜、軟骨膜、骨軟骨塊）移植等被應(yīng)用于臨床，長(zhǎng)期隨訪資料發(fā)現(xiàn):這些修復(fù)組織在壓力刺激下容易發(fā)生退變。通過(guò)組織工程技術(shù)

2、構(gòu)建的組織工程軟骨被認(rèn)為是目前最有可能解決此難題的技術(shù)手段。
　　組織工程修復(fù)軟骨的方法就是將種子細(xì)胞培養(yǎng)在生物材料支架上然后移植到缺損部位，形成新的軟骨組織，經(jīng)過(guò)重塑形并與機(jī)體組織整合在一起，是軟骨組織工程修復(fù)軟骨損傷的基本方式。作為組織工程的重要因素之一的支架材料已被廣泛研究，從仿生學(xué)角度，支架材料除了提供工程化軟骨樣組織的三維幾何形狀，還為細(xì)胞提供了生存的微環(huán)境（人造臨時(shí)細(xì)胞外基質(zhì)），支持細(xì)胞的粘附、增殖、分化并最終形成新的

3、軟骨組織。
　　將天然豬軟骨超微濕法粉碎，利用定向結(jié)晶技術(shù)及冷凍干燥技術(shù)，采用物理/化學(xué)方法交聯(lián)，得到軟骨細(xì)胞外基質(zhì)來(lái)源的三維多孔定向取向支架(orientedscaffold，OS)此支架具備了結(jié)構(gòu)，力學(xué)和生物化學(xué)特性類(lèi)似于自然軟骨的組織工程支架，管道孔的結(jié)構(gòu)和直徑分布均勻，在一定程度上類(lèi)似于自然關(guān)節(jié)軟骨。然而采用人的關(guān)節(jié)軟骨制備支架來(lái)源極為有限，我們需要尋求一種材料來(lái)源取代之，考慮到豬與人的同源性高，且來(lái)源豐富，故利用豬的關(guān)節(jié)

4、軟骨作為材料來(lái)源制備支架，本實(shí)驗(yàn)將從豬來(lái)源關(guān)節(jié)軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)支架的生物相容性及免疫炎癥反應(yīng)方面進(jìn)行評(píng)估，以確保其安全性。
　　方法:
　　(1)取豬四肢關(guān)節(jié)軟骨，分別制備脫細(xì)胞和未脫細(xì)胞軟骨支架。在人軟骨細(xì)胞中分別加入濃度為100％、50％、25％的脫細(xì)胞軟骨支架浸提液[無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液與支架表面積按1ml:(3-6) cm2比例混合，37℃靜置72h]，計(jì)算對(duì)增殖率，判定其體外細(xì)胞毒性。0.9％ NaCl與支架表面積按

5、1ml:(3-6) cm2比例混合，37℃靜置72h制備脫細(xì)胞軟骨支架浸提液，分別用于全身急性毒性實(shí)驗(yàn)（小白鼠）、溶血實(shí)驗(yàn)、熱原檢測(cè)實(shí)驗(yàn)、皮內(nèi)刺激實(shí)驗(yàn)（大白兔），分別觀察其體內(nèi)毒性、溶血程度、熱原和刺激情況。在大白兔體內(nèi)分別埋植脫細(xì)胞軟骨支架與未脫細(xì)胞軟骨支架，觀察炎癥反應(yīng)和細(xì)胞免疫情況。
　　(2)取豬膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨組織，體外分離、培養(yǎng)軟骨細(xì)胞，進(jìn)行蕃紅“O”、甲苯胺藍(lán)及Ⅱ型膠原免疫組化染色等表型鑒定。
　　(3)將軟骨細(xì)

6、胞與脫細(xì)胞軟骨支架復(fù)合，構(gòu)建出三維多孔組織工程支架，并對(duì)其進(jìn)行大體、電鏡、組織學(xué)觀察，
　　(4)采用PKH26熒光染料標(biāo)記，構(gòu)建軟骨細(xì)胞-ACECM支架復(fù)合體，觀察細(xì)胞在支架上的生長(zhǎng)情況。
　　結(jié)果:
　　(1)豬脫細(xì)胞軟骨支架浸提液對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)抑制作用，無(wú)細(xì)胞毒性。注射支架浸提液后小白鼠一般情況良好，無(wú)全身急性毒性反應(yīng)。支架浸提液溶血程度為1.3％，無(wú)溶血作用。支架浸提液無(wú)熱原存在且原發(fā)刺激指數(shù)為0分，皮內(nèi)刺激實(shí)驗(yàn)

7、陰性。脫細(xì)胞軟骨支架與未脫細(xì)胞軟骨支架相比免疫原性小，無(wú)炎癥反應(yīng)和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　(2)體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞經(jīng)蕃紅“O”、甲苯胺藍(lán)及Ⅱ型膠原免疫組化染色均為陽(yáng)性，證實(shí)具有正常軟骨細(xì)胞的表型。
　　(3)體外構(gòu)建的細(xì)胞支架復(fù)合體，AO-PI染色表明支架內(nèi)部均為活細(xì)胞，組織學(xué)結(jié)果表明蕃紅“O”、Ⅱ型膠原免疫組化染色陽(yáng)性，電鏡、組織學(xué)以及PKH26熒光標(biāo)記結(jié)果表明隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，細(xì)胞在支架中增殖顯著，細(xì)胞外有大量基質(zhì)分泌。<