1、背景：KCNA5基因(Potassium voltage-gated channel,shaker-related subfamily,member 5)編碼的KCNA5 通道（Kv1.5 鉀通道）介導(dǎo)了心房的超速激活延遲整流鉀電流(ultrarapidlyactivat ing delayed rectifier potassium current ,I kur)。I kur 僅存在于心房肌，不存在于心室肌。由于房顫（atrial f

2、ibrillat ion ,AF ）的發(fā)生發(fā)展與心房I kur的異常存在密切關(guān)系，因此目前認(rèn)為KCNA5 通道蛋白是治療AF的一個(gè)理想靶點(diǎn)。FHL2 由4個(gè)半LIM 結(jié)構(gòu)域組成，屬于LIM-only蛋白家族，在FHL 家族中有較為深入的研究。已知FHL2 通過與轉(zhuǎn)錄因子、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)物和轉(zhuǎn)錄輔助因子等相互作用參與多種信號(hào)轉(zhuǎn)錄過程，且參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程。最新研究表明FHL 家族另一成員FHL1（與FHL2 有47.9%的氨基酸相同），

3、與KCNA5 通道蛋白相互作用并調(diào)控其表達(dá)及功能。FHL1 主要在骨骼肌中表達(dá)，而FHL2 則主要在心肌細(xì)胞中表達(dá)，因此闡明FHL2 是否與KCNA5 相互作用更加有助于深刻理解心臟KCNA5 通道的調(diào)控，為開發(fā)更為理想的治療房顫藥物提供了研究思路。
　　 目的：運(yùn)用免疫共沉淀和免疫熒光技術(shù)初步驗(yàn)證FHL2 蛋白與KCNA5 蛋白間的相互作用，為進(jìn)一步研究對(duì)KCNA5 蛋白功能表達(dá)的調(diào)節(jié)奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：（1）質(zhì)粒

4、構(gòu)建：以編碼KCNA5的全長cDNA 為模板，通過PCR 方法在其開放讀框的兩端分別加上Hind Ⅲ（5 ’端）和EcoR Ⅰ（3 ’端）兩個(gè)酶切位點(diǎn)，去除末端的終止密碼；應(yīng)用Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ分別酶切pcDNA3.1/myc -His C 質(zhì)粒和PCR 產(chǎn)物，應(yīng)用DNA 連接酶將線性的pcDNA3.1/myc -His C和PCR 產(chǎn)物進(jìn)行連接，得到pcDNA3.1/myc -His C-KCNA5質(zhì)粒。pcDNA3.0-FH

5、L2 由導(dǎo)師提供（已經(jīng)測(cè)序鑒定）。（2 ）細(xì)胞培養(yǎng)和基因轉(zhuǎn)染：培養(yǎng)HEK293細(xì)胞，應(yīng)用Lipofectamine 2000 將pcDNA3.1/myc -His C-KCNA5 質(zhì)粒和pcDNA3.0-FHL2 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293 細(xì)胞。（3 ）免疫共沉淀：將抗FHL2 特異性抗體和總蛋白進(jìn)行混合，再加入Protein A/G Plus-Agarose 進(jìn)行混合，離心沉淀，將沉淀物進(jìn)行電泳，隨后應(yīng)用抗Myc抗體進(jìn)行Western

6、Blot分析。（4 ）免疫熒光細(xì)胞化學(xué)分析：將質(zhì)粒pcDNA3.1/myc -HisC-KCNA5和pcDNA3.0-FHL2 共轉(zhuǎn)染HEK293 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 小時(shí)后固定，應(yīng)用抗FHL2一抗（羊來源）和Alexa 488 標(biāo)記的驢抗羊二抗檢測(cè)FHL2 蛋白，應(yīng)用抗Myc 一抗（兔來源）和Alexa 555 標(biāo)記的驢抗兔二抗檢測(cè)KCNA5-Myc 融合蛋白。
　　 結(jié)果：（1 ）成功構(gòu)建pcDNA3.1/myc -His C-

7、KCNA5 質(zhì)粒，并經(jīng)測(cè)序證明KCNA5 編碼的蛋白與載體的myc-His 在同一讀框，堿基無突變。（2 ）pcDNA3.1/myc -His C-KCNA5和pcDNA3.0-FHL2 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293 細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)和WesternBlot，實(shí)驗(yàn)組和陽性對(duì)照組均可見一條約75KD 大小的條帶，與KCNA5-myc-His 融合蛋白大小相當(dāng)，陰性對(duì)照組未見條帶。（3 ）質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293 細(xì)胞，進(jìn)行免疫