1、目的:糖尿病并發(fā)癥是威脅人類健康的世界性公共衛(wèi)生問題。糖尿病血管并發(fā)癥發(fā)病率高,其中周圍血管病變所致下肢缺血可致足潰瘍,甚至截肢,是糖尿病致殘的重要因素,給病人及家屬帶來極大的痛苦及負(fù)擔(dān)。糖尿病下肢缺血發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,目前認(rèn)為主要因?yàn)槭莿?dòng)脈粥樣硬化同時(shí)伴側(cè)支循環(huán)受損,其中側(cè)支血管能力形成受損占重要地位。近年來的大量研究表明內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)在血管形成中起重要作用。正常情況下循環(huán)EPC的相對(duì)數(shù)量較少,而在創(chuàng)傷或缺血時(shí)顯著增加。但糖尿病患者

2、EPC增殖能力遠(yuǎn)低于非糖尿病患者,且與活化內(nèi)皮細(xì)胞的粘附、增殖以及形成小血管的能力下降,缺血組織對(duì)外源性生長(zhǎng)因子反應(yīng)性也降低。臍血中存在內(nèi)皮祖細(xì)胞,其數(shù)目高于同等量外周血,取材無創(chuàng)傷,易找到HLA相合的供者,可長(zhǎng)期保存。使用臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞治療糖尿病血管病變是一個(gè)值得研究的領(lǐng)域,但目前國(guó)內(nèi)外尚缺乏此方面的實(shí)驗(yàn)研究。故本研究采用鏈脲佐菌素(STZ)建立糖尿病模型,結(jié)扎大鼠雙后肢股動(dòng)脈形成下肢缺血,應(yīng)用射線照射減輕大鼠排斥反應(yīng),抽取足月產(chǎn)婦臍

3、血,分離臍血單核細(xì)胞,培養(yǎng)細(xì)胞7天,獲得內(nèi)皮祖細(xì)胞,經(jīng)尾靜脈注射或者局部肌肉注射,將內(nèi)皮祖細(xì)胞移植入大鼠。熒光示蹤內(nèi)皮祖細(xì)胞,觀察大鼠雙后肢潰瘍變化情況,通過對(duì)腓腸肌中Ⅷ因子與VEGF表達(dá)的研究,探討臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞治療糖尿病下肢缺血的效果及方法。方法:1、臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定:取產(chǎn)婦足月產(chǎn)臍血50 ml,運(yùn)用密度梯度離心法分離獲得單核細(xì)胞,利用內(nèi)皮祖細(xì)胞貼壁的生長(zhǎng)特性,培養(yǎng)細(xì)胞7天,貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞即含內(nèi)皮祖細(xì)胞。將培養(yǎng)細(xì)胞消化

4、,‘用細(xì)胞表達(dá)因子(CD133,CD34,KDR)經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定內(nèi)皮祖細(xì)胞,并計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù),達(dá)到移植有效活細(xì)胞數(shù)。2、糖尿病大鼠模型的建立及分組:將20只體重約200～250 g的健康雄性Wistar大鼠常規(guī)喂養(yǎng)一周后,隨機(jī)選取15只給予一次性腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)55 mg/kg復(fù)制糖尿病模型,5只正常大鼠給予檸檬酸緩沖液等容量注射作為正常對(duì)照組。上述大鼠分為四組:①糖尿病股動(dòng)脈結(jié)扎后經(jīng)尾靜脈注射EPC治療組(Diabetes

5、+ligation+intravenous injection,DLV):上述糖尿病大鼠射線照射后結(jié)扎雙后肢股動(dòng)脈,復(fù)制缺血模型,再經(jīng)尾靜脈注射EPC,觀察經(jīng)尾靜脈注射EPC治療后下肢缺血的療效。②糖尿病股動(dòng)脈結(jié)扎后局部肌肉注射EPC治療組(Diabetes+ligation+intramuscular injection,DLM):糖尿病大鼠射線照射后結(jié)扎雙后肢股動(dòng)脈,右后肢局部注射EPC,觀察缺血局部肌肉注射EPC治療后下肢缺血的療

6、效。左后肢局部注射等體積磷酸鹽緩沖液(PBS)作為糖尿病股動(dòng)脈結(jié)扎治療的對(duì)照組(Diabetes+ligation+control,DLC)。③糖尿病未處理組:糖尿病不結(jié)扎不注射EPC(Diabetes control withoutEPC injection and ligation,DC)。④正常大鼠股動(dòng)脈結(jié)扎后經(jīng)尾靜脈EPC移植治療組(Normal+ligation+intravenous injection,NLV):正常血糖大

7、鼠射線照射后結(jié)扎雙后肢股動(dòng)脈,尾靜脈注射EPC。3、各組大鼠進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn):①熒光示蹤內(nèi)皮祖細(xì)胞:用GFP(綠色熒光)在內(nèi)皮祖細(xì)胞注射前轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細(xì)胞,轉(zhuǎn)染成功后移植入大鼠,一周后取腓腸肌組織作冰凍切片,觀察有無熒光表達(dá)并對(duì)比熒光強(qiáng)度,示蹤內(nèi)皮祖細(xì)胞是否到達(dá)缺血部位。②腓腸肌HE染色與Ⅷ因子免疫組化染色觀察毛細(xì)血管數(shù):注射內(nèi)皮祖細(xì)胞后21天,處死大鼠,無菌操作取腓腸肌,固定,脫水,石蠟包埋,行HE染色和Ⅷ因子的免疫組化染色,通過觀察肌纖維

8、間毛細(xì)血管數(shù)情況了解內(nèi)皮祖細(xì)胞治療后側(cè)支循環(huán)有無改善,內(nèi)皮祖細(xì)胞治療糖尿病下肢缺血的療效。③RT-PCR檢測(cè)雙后肢腓腸肌VEGF mRNA表達(dá):注射內(nèi)皮祖細(xì)胞后21天,處死大鼠,無菌操作取腓腸肌,行RT-PCR檢測(cè)VEGF mRNA表達(dá),從基因水平研究?jī)?nèi)皮祖細(xì)胞治療糖尿病下肢缺血的療效。4、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù),計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,DLC組與DLM組、DLV組、NLV組、DC組間應(yīng)用單因

9、素方差分析及SNK-q檢驗(yàn),DLV組與DLM組間使用配對(duì)設(shè)計(jì)均數(shù)比較t檢驗(yàn),P<0.05表示統(tǒng)計(jì)學(xué)有意義。結(jié)果:1、分離的臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞的鑒定:流式細(xì)胞儀測(cè)定培養(yǎng)7天細(xì)胞CD34含量最高,CD133次之,KDR含量最少,提示為早期內(nèi)皮祖細(xì)胞。2、大鼠一般情況及大鼠雙后肢缺血變化情況:與正常大鼠比較,糖尿病組在注射STZ兩天后開始出現(xiàn)明顯多飲、多尿、毛發(fā)干枯。結(jié)扎股動(dòng)脈后到21天處死期間,注射內(nèi)皮祖細(xì)胞的后肢,其缺血及潰瘍愈合較未注射內(nèi)皮

10、祖細(xì)胞后肢改善明顯,愈合速度加快。尾靜脈注射肢與局部注射肢改善差別不明顯。糖尿病大鼠與正常大鼠潰瘍恢復(fù)無明顯差別。3、內(nèi)皮祖細(xì)胞的熒光示蹤情況:注射內(nèi)皮祖細(xì)胞腓腸肌中有熒光表達(dá),熒光亮度強(qiáng),尾靜脈注射與局部注射熒光亮度相似；DLC組腓腸肌中有熒光表達(dá),但很少；DC組腓腸肌無熒光表達(dá)。4、腓腸肌HE染色與Ⅷ因子免疫組化染色情況:各組每低倍鏡視野毛細(xì)血管數(shù)均值:DLC(4.75±0.957),DLM(18.5±8.737),DLV(18.7

11、5±4.349),NLV(21±2.944),DC(17±3.162)。注射內(nèi)皮祖細(xì)胞與DC組腓腸肌中毛細(xì)血管數(shù)多于DLC組腓腸肌中毛細(xì)血管數(shù),分布密集,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；尾靜脈注射與局部注射相比毛細(xì)血管數(shù)無明顯差別(P>0.05)。5、VEGF mRNA的表達(dá)情況:各組VEGF mRNA2-△△CT均值:DLC(1.029±0.293),DLM(2.707±0.946),DLV(2.621±0.414),NLV(3.

12、121±1.734),DC(3.414±0.677)。糖尿病注射EPC(DLM、DLV組)、正常尾靜脈注射EPC(NLV組)以及糖尿病未結(jié)扎股動(dòng)脈未注射EPC(DC組)大鼠腓腸肌VEGF表達(dá)較糖尿病結(jié)扎股動(dòng)脈未注射EPC(DLC組)腓腸肌增高,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),尾靜脈注射與局部注射肢腓腸肌VEGF表達(dá)無明顯差異(P>0.05)。糖尿病大鼠尾靜脈注射與正常大鼠尾靜脈注射無明顯區(qū)別(P>0.05)。結(jié)論:1、臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞