1、背景及目的：用健康的組織器官代替病變、衰竭的器官而重建其正常的生理功能，一直是臨床醫(yī)生追求的目標(biāo)，但同種異體移植物在移植后出現(xiàn)排斥反應(yīng)，造成移植物功能喪失，多年來，臨床及實(shí)驗(yàn)室工作者一直努力尋找減輕及消除排斥反應(yīng)的方法；目前預(yù)防和治療排斥反應(yīng)的方法分為非藥物治療及藥物治療，前者在過去的免疫抑制治療中使用過，比如射線輻射、胸導(dǎo)管插管淋巴引流、脾切除及局部免疫抑制等，但其中一些不良反應(yīng)較多，現(xiàn)已很少使用。免疫抑制藥物治療是當(dāng)今應(yīng)用最多的，新

2、型的免疫抑制藥物不斷的推出，給臨床工作帶來了極大的幫助，但長期服用免疫抑制劑所引起的諸如感染，惡性腫瘤以及免疫抑制劑本身的毒副作用等，極大地影響了器官或細(xì)胞移植的成功率和受者的長期存活率。隨著基因工程重組技術(shù)的發(fā)展，能夠誘導(dǎo)耐受、減緩排斥反應(yīng)，更具有特異性的基因治療為我們開辟了新的治療途徑。MHC-Ⅰ抗原作為異體移植物的主要攻擊靶點(diǎn)，如果降低MHC-Ⅰ在供體細(xì)胞上的表達(dá)抑或敲除MHC-Ⅰ抗原，則可能大大減輕、甚至避免排斥反應(yīng)發(fā)生。為此，

3、本研究構(gòu)建針對(duì)人類MHC-Ⅰ細(xì)胞內(nèi)抗體的腺相關(guān)病毒，轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，驗(yàn)證MHC-Ⅰ細(xì)胞內(nèi)抗體在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中的打靶作用，探討其在移植免疫排斥反應(yīng)中的作用和意義。 方法：1．應(yīng)用PCR技術(shù)和T載體克隆法克隆抗MHC-Ⅰ細(xì)胞內(nèi)抗體基因（F105VH-scFv-KDEL），酶切鑒定，并進(jìn)行DNA測序及分析。2．酶切獲取F105VH-scFv-KDEL融合基因片段，將其插入質(zhì)粒pSSHG腺相關(guān)病毒載體中的EcoRⅠ-BamHⅠ

4、位點(diǎn)，構(gòu)建重組腺相關(guān)病毒載體質(zhì)粒pSSHG/F105VH-scFv-KDEL。3．用腺病毒輔助質(zhì)粒pFG140、包裝質(zhì)粒pAAV/Ad及已構(gòu)建的重組腺相關(guān)病毒載體質(zhì)粒，三質(zhì)粒磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)染293細(xì)胞系，包裝重組攜帶F105VH-scFv-KDEL融合基因的腺相關(guān)病毒載體。經(jīng)斑點(diǎn)雜交方法測定重組病毒滴度。4．將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系ECV304細(xì)胞分為重組腺相關(guān)病毒組及PBS對(duì)照組，前者以重組腺相關(guān)病毒感染ECV304，后者以等量PBS液

5、處理；RT—PCR方法檢測F105VH-scFv-KDEL基因片段是否成功整合入人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。5．免疫細(xì)胞化學(xué)方法對(duì)比重組腺相關(guān)病毒組及PBS組細(xì)胞表面MHC-Ⅰ的表達(dá)情況。6．微量細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)方法觀察兩組細(xì)胞的存活狀況。 結(jié)果：1．F105VH-scFv-KDEL融合基因經(jīng)酶切電泳鑒定正確，經(jīng)DNA測序與Genebank序列完全一致。2．pSSHG/MHC-Ⅰ酶切圖譜證實(shí)MHC-Ⅰ細(xì)胞內(nèi)抗體基因片段克隆入pSSHG/CMV質(zhì)

6、粒載體中。3．斑點(diǎn)雜交測定病毒的滴度為3．4×109-3．4×1010PFU/ml。4．RT-PCR檢測到F105VH-scFv-KDEL基因片段成功整合入人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。5．免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測到ECV304細(xì)胞表面MHC-Ⅰ的表達(dá)，對(duì)比顯示，重組腺相關(guān)病毒組細(xì)胞表面MHC-Ⅰ的表達(dá)明顯少于PBS組。6．微量細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)方法證實(shí)重組腺相關(guān)病毒組存活細(xì)胞明顯多于PBS組。 結(jié)論：1．成功克隆F105VH-scFv-KDEL融合基