1、我國(guó)是世界上肝病發(fā)病率最高和因肝病導(dǎo)致死亡人數(shù)最多的國(guó)家之一，同時(shí)也是接受肝移植治療的患者較多和肝移植發(fā)展較快的國(guó)家。肝移植后，肝臟無(wú)功能或肝衰仍然是一個(gè)重要的臨床問(wèn)題。同時(shí)，移植器官的短缺迫使人們不得不采用一些邊緣供肝，而這些供肝對(duì)缺血再灌注損傷更敏感，使移植肝原發(fā)性功能障礙的發(fā)生率顯著提高，這在相當(dāng)程度上限制了肝移植的發(fā)展。如何避免這些損傷是目前肝移植研究領(lǐng)域的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。 研究表明，肝移植缺血再灌注損傷過(guò)程中，NF—κB的

2、激活導(dǎo)致其下游基因—炎性介質(zhì)的大量表達(dá)，從而在移植后缺血再灌注損傷過(guò)程中發(fā)揮重要作用。因此，我們可以設(shè)想抑制NF—κB的激活或表達(dá)有望調(diào)節(jié)或減輕缺血再灌注損傷。RNAi技術(shù)可以高效沉默特定基因，去除移植過(guò)程中不利基因的表達(dá)，在器官移植方面具有廣泛的應(yīng)用前景。有效的基因治療方案需要將目的基因穩(wěn)定、高效地轉(zhuǎn)入移植物的細(xì)胞。腺病毒載體因具有嗜肝性、能夠轉(zhuǎn)染處于非增殖期的實(shí)質(zhì)細(xì)胞而在肝臟疾病研究方面具有優(yōu)勢(shì)。 第一部分、siRNA轉(zhuǎn)染B

3、RL細(xì)胞時(shí)轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化 目的：探討用RNAi—mate試劑轉(zhuǎn)染siRNA至BRL細(xì)胞的最佳轉(zhuǎn)染條件。 方法：設(shè)立不同的2種RNAi—mate量和4種siRNA量，交叉組合成8個(gè)不同比例的復(fù)合物，即8個(gè)實(shí)驗(yàn)組，分別轉(zhuǎn)染接種培養(yǎng)的BRL細(xì)胞，24小時(shí)后，觀察細(xì)胞陽(yáng)性轉(zhuǎn)染率和細(xì)胞存活率。 結(jié)果：siRNA的量為1．5ug，RNAi—mate為3．0ul時(shí)，其轉(zhuǎn)染效率為89%，細(xì)胞的生存率為84%，優(yōu)于其它條件時(shí)的轉(zhuǎn)染

4、效率并能保證相對(duì)小的細(xì)胞毒性。 結(jié)論：在本實(shí)驗(yàn)中，用siRNA轉(zhuǎn)染BRL細(xì)胞，當(dāng)siRNA與RNAi—mate比例為1：2時(shí)，為最佳轉(zhuǎn)染條件。 第二部分、siRNA對(duì)BRL大鼠肝細(xì)胞NF—κB p65表達(dá)影響的研究 目的：篩選出能高效抑制NF—κB p65表達(dá)的siRNA序列。 方法：設(shè)計(jì)制備4對(duì)針對(duì)大鼠NF—κB p65的siRNA，結(jié)合對(duì)照共分為7個(gè)實(shí)驗(yàn)組，采用研究一的轉(zhuǎn)染條件體外轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的BRL細(xì)胞

5、，采用逆轉(zhuǎn)錄PCR和Western blotting檢測(cè)siRNA的基因沉默效果。 結(jié)果：設(shè)計(jì)合成的4對(duì)siRNA均不同程度的從mRNA和蛋白表達(dá)水平抑制了BRL細(xì)胞NF—κB p65的表達(dá)，其中第二對(duì)siRNA mRNA和蛋白水平的抑制率分別為90%和80%。 結(jié)論：4對(duì)siRNA轉(zhuǎn)染BRL細(xì)胞后，均能發(fā)揮RNA干擾作用。第二對(duì)siRNA抑制效率最高。 第三部分、針對(duì)NF—κB p65的siRNA重組腺病毒的制

6、備及病毒包裝、擴(kuò)增和滴度測(cè)定 目的：構(gòu)建針對(duì)NF—κB p65的siRNA重組腺病毒。 方法：將NF—κB p65 shRNA表達(dá)框插到穿梭質(zhì)粒pShuttle H1的啟動(dòng)子下游，鑒定包含目的基因的正確克隆，將其線性化后與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy—1體外同源重組，共轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，篩選重組子并擴(kuò)增。重組子線性化后，轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞中進(jìn)行病毒的包裝，同時(shí)大量擴(kuò)增病毒，氯化銫密度梯度離心純化。重組腺病毒轉(zhuǎn)染BRL細(xì)胞檢測(cè)

7、NF—κB p65基因沉默效率。 結(jié)果：穿梭載體插入序列及重組腺病毒質(zhì)粒的鑒定均完全正確。病毒擴(kuò)增純化后滴度為3．0×10pfu/ml，并能在體外抑制NF—κB p65蛋白表達(dá)。 結(jié)論：成功構(gòu)建了針對(duì)NF—κB p65的siRNA重組腺病毒。 第四部分、大鼠原位肝臟移植模型的建立 目的：用改良二袖套法建立穩(wěn)定的大鼠原位肝臟移植模型。 方法：在Kamada“二袖套法”的基礎(chǔ)上，在取肝、肝上下腔靜脈的

8、吻合、圍手術(shù)期處理等幾方面進(jìn)行改良，共施行大鼠原位肝移植動(dòng)物實(shí)驗(yàn)140例，觀察術(shù)后并發(fā)癥及存活率。 結(jié)果：經(jīng)過(guò)140例次的訓(xùn)練，建立了穩(wěn)定的大鼠原位肝臟移植模型。在實(shí)驗(yàn)的第三階段，受體無(wú)肝期平均12分鐘，手術(shù)成功率93%，兩周存活率90%。 結(jié)論：改良的二袖套法具有無(wú)肝期短、手術(shù)成功率高、大鼠術(shù)后存活時(shí)間長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)，是大鼠原位肝移植的理想術(shù)式。嫻熟細(xì)致的外科操作、受體無(wú)肝期的長(zhǎng)短是決定動(dòng)物存活的關(guān)鍵。 第五部分、A

9、d—shRNA—p65在大鼠移植肝缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用 目的：觀測(cè)構(gòu)建的Ad—shRNA—p65腺病毒載體在大鼠體內(nèi)的基因沉默效果及其在大鼠原位移植肝缺血再灌注損傷中的保護(hù)作用。 方法：術(shù)前36小時(shí)將Ad—shRNA—p65通過(guò)門靜脈注入實(shí)驗(yàn)組供體大鼠肝臟，3．0×109/只。移植術(shù)前處死一批大鼠，檢測(cè)血ALT、AST、LDH，肝臟病理，NF—κB p65的mRNA、蛋白表達(dá)。供肝獲取后冷保存4小時(shí)，改良的二袖套法

10、行原位肝臟移植術(shù)。門靜脈復(fù)流6小時(shí)后觀測(cè)受體膽汁分泌情況，處死受體大鼠，檢測(cè)血ALT、AST、LDH，肝臟病理，肝組織MDA水平，NF—κB p65的mRNA、蛋白表達(dá)以及免疫組化；TNF—α、MIP—2、ICAM—1mRNA表達(dá)，TNF—α的免疫組化，TUNEL法檢測(cè)肝臟細(xì)胞凋亡水平。 結(jié)果：移植術(shù)前，實(shí)驗(yàn)組NF—κB p65的mRNA、蛋白表達(dá)降低，實(shí)驗(yàn)組和空病毒組血生化指標(biāo)升高。術(shù)后6小時(shí)，實(shí)驗(yàn)組膽汁分泌量多于對(duì)照組，血生

11、化指標(biāo)降低，MDA水平、NF—κB p65的mRNA、蛋白表達(dá)明顯低于對(duì)照組，TNF—α、MIP—2、ICAM—1mRNA低表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞形態(tài)變化較輕，凋亡水平明顯低于對(duì)照組。 結(jié)論：構(gòu)建的腺病毒載體Ad—shRNA—p65能成功地轉(zhuǎn)染供肝，并有效沉默NF—κBp65表達(dá)，轉(zhuǎn)染本身對(duì)供肝可能有輕微的損害。Ad—shRNA—p65預(yù)處理的供肝能夠抑制移植肝缺血再灌注損傷引起的NF—κB p65激活和表達(dá)，并減輕移植肝的缺血再灌注