1、甲羥戊酸是大多數(shù)真核生物和高等植物細(xì)胞中普遍存在的一種重要的有機(jī)酸，是甲羥戊酸途徑（MVApathway）的中間產(chǎn)物。甲羥戊酸在高等動物體內(nèi)的濃度可以指示固醇的含量水平；在合成有價值的萜類物質(zhì)的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加甲羥戊酸可成倍的提高萜類產(chǎn)量；此外它在化工行業(yè)也有重要的用途，這使得對甲羥戊酸，尤其是天然R型的甲羥戊酸的需求大大增加。而常見的化學(xué)合成法，酶催化法合成具有原料難得、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、成本較高，不適于大規(guī)模生產(chǎn)，合成的甲羥戊酸多為外消旋混

2、合物等缺點(diǎn)，因此利用生物體合成甲羥戊酸成為發(fā)展趨勢。大腸桿菌作為一個成熟的遺傳操作系統(tǒng)成為首選宿主，而且大腸桿菌不能利用甲羥戊酸，更有利于甲羥戊酸的生產(chǎn)。 甲羥戊酸途徑是大多數(shù)真核細(xì)胞，少數(shù)原核細(xì)胞和高等植物合成異戊二烯焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）的經(jīng)典途徑，IPP和DMAPP是萜類合成的前體物。另外有一條新發(fā)現(xiàn)的1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸途徑（DXPpathway），存在于多數(shù)真細(xì)菌和高等植物細(xì)胞中，

3、也是生物合成萜類前體的途徑。 本課題將來源于糞鏈球菌的MVA途徑的mvaS，mvaE，mvaK1，mvaD，mvaK2五個酶基因通過質(zhì)?？寺〉酱竽c桿菌體內(nèi)。MVA途徑的上游基因mvaS，mvaE和下游基因mvaK1，mvaD，mvaK2分別克隆到兩個相互兼容的載體上，得到質(zhì)粒pZYSE和pZYKDK。同時，使用定點(diǎn)突變的方法，將3-羥基-3-甲基-戊二酸單酰輔酶A合酶（HMGS）中110位的丙氨酸突變?yōu)楦拾彼岬臅r候，可以將HMG

4、S的酶活提高140倍。在此基礎(chǔ)上克隆3-羥基-3-甲基-戊二酸單酰輔酶A還原酶（HMGR）基因，得到載體pZYSE，DH5α△ptsG/pZYSE發(fā)酵結(jié)果在GC檢測色譜圖上有新的峰出現(xiàn)，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)品證實(shí)為甲羥戊酸，產(chǎn)量為168mg/L。經(jīng)過代謝調(diào)節(jié)，使用基因敲除手段，將磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的ptsG基因，催化丙酮酸，乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為副產(chǎn)物乙酸的酶基因poxB和pta阻斷，得到菌株MG1655△ptsG△poxB△pta/pZYSE。對這個菌株進(jìn)行發(fā)

5、酵培養(yǎng)，甲羥戊酸的產(chǎn)量為284mg/L，進(jìn)一步在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入0.3％的甘油，甲羥戊酸的產(chǎn)量提高到747mg/L。 通過基因敲除，甲羥戊酸途徑起始物乙酰輔酶A和丙酮酸得到積累，增強(qiáng)了流向MVA途徑的代謝流，甲羥戊酸產(chǎn)量的提高實(shí)驗(yàn)也證明了這一點(diǎn)。甲羥戊酸途徑的下游途徑由mvaK1，mvaD，和mvaK2三個基因催化甲羥戊酸生成IPP。成功構(gòu)建的含有這三個基因的載體pZYKDK可以和pZYSE共存，將這兩個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，一