1、目的:
　　建立可對(duì)烈性病原體類(lèi)鼻疽伯克霍爾德氏菌與土拉弗朗西斯氏菌直接進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析(up-converting phosphor technology-based lateral-flow，UPT-LF)快速定量檢測(cè)方法。
　　方法:
　　1.上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析檢測(cè)試紙制備:以類(lèi)鼻疽伯克霍爾德氏菌、土拉弗朗西斯氏菌相應(yīng)的單克隆抗體作為特異性生物檢測(cè)探針，以上轉(zhuǎn)發(fā)光顆粒(up-convertingpho

2、sphor，UCP)為分析標(biāo)記物，分別建立雙抗體夾心模式免疫層析試紙:類(lèi)鼻疽伯克霍爾德氏菌上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析檢測(cè)試紙(Bur-UPT-LF)和土拉弗朗西斯氏菌上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析檢測(cè)試紙(Fra-UPT-LF)。
　　2.試紙檢測(cè)敏感性及特異性評(píng)價(jià):以類(lèi)鼻疽伯克霍爾德氏菌系列濃度菌懸液作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，評(píng)價(jià)Bur-UPT-LF的敏感性和定量能力;采用鼻疽伯克霍爾德氏菌、鼠疫耶爾森氏菌、銅綠假單胞菌等30株種屬近緣或傳播途徑近似的菌株進(jìn)行特異

3、性評(píng)價(jià)。以土拉弗朗西斯氏菌系列濃度菌懸液作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，評(píng)價(jià)Fra-UPT-LF的敏感性和定量能力;采用鼠疫耶爾森氏菌、炭疽芽孢、傷寒沙門(mén)氏菌等18株傳播途徑或感染癥狀類(lèi)似的菌株進(jìn)行特異性評(píng)價(jià)。
　　3.試紙現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)適用性模擬評(píng)價(jià):(1)樣品耐受性評(píng)價(jià)，采用不同濃度的純化學(xué)試劑（4類(lèi)7種）和模擬樣品（8類(lèi)15種）分別進(jìn)行試紙對(duì)單因素樣本和實(shí)際樣品的耐受性評(píng)價(jià)。(2)操作誤差兼容性評(píng)價(jià)，設(shè)置一定程度的操作誤差，包括樣品體積偏差、樣品處

4、理液體積偏差、上樣體積偏差，模擬實(shí)驗(yàn)室外、現(xiàn)場(chǎng)非精確操作條件下對(duì)試紙檢測(cè)性能的影響。
　　結(jié)果:
　　1.上轉(zhuǎn)發(fā)光免疫層析檢測(cè)試紙制備:將上轉(zhuǎn)發(fā)光顆粒與抗類(lèi)鼻疽伯克霍爾德氏菌單克隆抗體(2E5、3D6、8G1)進(jìn)行生物偶聯(lián);抗類(lèi)鼻疽伯克霍爾德氏菌單克隆抗體186(3 mg/ml)和羊抗鼠IgG(3 mg/ml)分別作為檢測(cè)帶(T)和質(zhì)控帶(C)固定在硝酸纖維素膜上，成功建立了Bur-UPT-LF試紙，并確定了最優(yōu)樣品處理液（

5、樣品墊處理液含1％NaCl)。將上轉(zhuǎn)發(fā)光顆粒與抗土拉弗朗西斯氏菌單克隆抗體12H1進(jìn)行生物偶聯(lián);抗土拉弗朗西斯氏菌單克隆抗體(4H10+1C5)(2 mg/ml)和羊抗鼠IgG(2 mg/ml)分別作為檢測(cè)帶(T)和質(zhì)控帶(C)固定在硝酸纖維素膜上，成功建立了Fra-UPT-LF試紙，并確定了最優(yōu)樣品處理液(樣品墊處理液含1％ BSA)。
　　2.試紙檢測(cè)敏感性及特異性評(píng)價(jià):Bur-UPT-LF檢測(cè)限為104 cfu/ml;在10

6、4cfu/ml～107 cfu/ml的范圍內(nèi)具有優(yōu)良的線性定量檢測(cè)能力（r=0.996）;特異性佳，與鼻疽伯克霍爾德氏菌、常見(jiàn)細(xì)菌類(lèi)生物戰(zhàn)劑以及環(huán)境菌群等均無(wú)交叉反應(yīng)。Fra-UPT-LF檢測(cè)限為104 cfu/ml;在104 cfu/ml～108 cfu/ml的范圍內(nèi)具有優(yōu)良的線性定量檢測(cè)能力（r=0.995）;特異性佳，與常見(jiàn)細(xì)菌類(lèi)生物戰(zhàn)劑以及環(huán)境菌群等均無(wú)交叉反應(yīng)。
　　3.試紙現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)適用性模擬評(píng)價(jià):(1)兩種檢測(cè)試紙均具

7、有較強(qiáng)的樣品單因素沖擊耐受性。Bur-UPT-LF試紙可耐受pH1-12(即HCl≤0.1 mol/L、NaOH≤0.01 mol/L)，離子強(qiáng)度≤2 mol/L(NaCl+KCl≤2 mol/L)，粘稠度PEG20000≤50 mg/ml與甘油≤20％,生物大分子基質(zhì)干擾BSA≥400 mg/ml與干酪素≥80 mg/ml等。Fra-UPT-LF試紙可耐受pH2-13(HCl≤0.01 mol/L、NaOH≥0.1 mol/L)，離子

8、強(qiáng)度≥2 mol/L(NaCl+KCl≥2 mol/L)，粘稠度PEG20000≤50 mg/ml與甘油≥20％，生物大分子基質(zhì)干擾BSA≥400 mg/ml與干酪素≥80 mg/ml等。(2)兩種檢測(cè)試紙均可在20min內(nèi)對(duì)面粉、奶粉、膩?zhàn)臃?、土壤、果珍以及臟器等復(fù)雜樣品中的類(lèi)鼻疽伯克霍爾德氏菌、土拉弗朗西斯氏菌進(jìn)行準(zhǔn)確定量檢測(cè);(3)樣品體積偏差(-50％～+200％)、樣品處理液體積偏差(-22％～+44％)或上樣體積偏差(-30