1、艾滋病，又名獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)，是一種由人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)引起的傳染性疾病。該病傳播迅速，死亡率極高，被稱為“二十世紀(jì)瘟疫"。研制安全且有效的疫苗對(duì)于控制艾滋病的傳播非常重要。在過(guò)去，人們?cè)欢日J(rèn)為，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)HIV包膜蛋白的體液免疫應(yīng)答是艾滋病疫苗研制的主要方向。然而由于病毒的逃逸

2、作用，疫苗誘導(dǎo)的中和抗體被證實(shí)難以有效的完全防御HIV的入侵?？茖W(xué)家們發(fā)現(xiàn)，艾滋病病原體的gag基因及所編碼蛋白在序列上相對(duì)比較保守，是疫苗研制的理想標(biāo)靶。臨床研究指出，在HIV感染者中有一群長(zhǎng)期感染但無(wú)發(fā)病的個(gè)體，他們體內(nèi)存在著相對(duì)高水平的Gag-特異性CTL應(yīng)答。另一些研究表明，針對(duì)Gag-p17的CTL應(yīng)答與患者病毒載量呈負(fù)相關(guān)。以上發(fā)現(xiàn)提示了針對(duì)艾滋病病毒Gag抗原的疫苗能夠增強(qiáng)機(jī)體的保護(hù)性免疫反應(yīng)。目前，世界不同國(guó)家針對(duì)gag

3、基因及其編碼產(chǎn)物已經(jīng)開發(fā)出許多相應(yīng)的疫苗候選物，其有效性以及安全性尚在實(shí)驗(yàn)研究階段。在所有疫苗候選物中，DNA疫苗是研究的一大熱點(diǎn)，被稱為“疫苗的第三次革命”。研究證實(shí)，DNA疫苗能夠在多種動(dòng)物體內(nèi)同時(shí)誘導(dǎo)體液免疫與細(xì)胞免疫應(yīng)答，給HIV感染的防治帶來(lái)了益處。 為了研究HIV gag DNA疫苗誘導(dǎo)抗原特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答的產(chǎn)生與維持，本實(shí)驗(yàn)室利用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建出HIV gag DNA疫苗，其核心序列為HIV(HXBc2病毒

4、株)的gag完整序列片斷。我們采用C57BL/6小鼠為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停约∪庾⑸浞▽?duì)其進(jìn)行HIV gag DNA疫苗免疫，分別于不同時(shí)間點(diǎn)后獲取脾與肺組織的單個(gè)細(xì)胞，在體外對(duì)其加入Gag抗原多肽刺激后，采用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ的水平，ELISPOT法檢測(cè)IFN-γ分泌細(xì)胞的頻率，流式細(xì)胞儀分析不同的特異性T細(xì)胞亞群及表型。結(jié)果顯示：末次免疫1周后，經(jīng)Gag多肽刺激的加強(qiáng)免疫組小鼠脾內(nèi)及肺組織內(nèi)IFN-γ產(chǎn)生的總體水平和分泌

5、細(xì)胞頻率均高于對(duì)照組及初次免疫組(P<0.05)，表明了加強(qiáng)免疫HIVgagDNA疫苗比初次免疫更能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗原特異性的細(xì)胞免疫效應(yīng)。而且該效應(yīng)同時(shí)存在于淋巴組織(脾)與非淋巴組織(肺)之中。運(yùn)用流式細(xì)胞儀技術(shù)，我們又發(fā)現(xiàn)，HIVgagDNA疫苗能同時(shí)誘導(dǎo)CD4<'+>和CD8<'+>兩群T細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)答。疫苗學(xué)的基礎(chǔ)在于提供長(zhǎng)期、有效的免疫記憶。為了探討HIV gag DNA疫苗誘導(dǎo)的特異性細(xì)胞免疫記憶應(yīng)答，我們?cè)谀┐蚊庖?周后，對(duì)

6、抗原特異性IFN-γ做了進(jìn)一步的檢測(cè)：經(jīng)多肽刺激后，加強(qiáng)免疫組IFN-γ的總體產(chǎn)生水平和分泌細(xì)胞頻率同樣均高于對(duì)照組及初次免疫組(P<0.05)。無(wú)論從總體水平還是從單細(xì)胞水平檢測(cè)的結(jié)果表明，小鼠加強(qiáng)免疫HIV gag DNA疫苗后其淋巴器官(脾)與非淋巴器官(肺)內(nèi)均存在有應(yīng)答功能的記憶性T細(xì)胞。證明了加強(qiáng)免疫疫苗與初次免疫相比，在誘導(dǎo)出更明顯的細(xì)胞免疫效應(yīng)的同時(shí)也保持了更高水平的細(xì)胞免疫記憶。這些發(fā)現(xiàn)提示我們?cè)诶肏IV gag D

7、NA疫苗進(jìn)行免疫時(shí)選擇“初免+加強(qiáng)”方式的必要性。 流式細(xì)胞技術(shù)分析得出，加強(qiáng)免疫組淋巴器官與非淋巴器官內(nèi)均存在CD4<'+>和CD8<'+>兩群抗原特異性記憶性T細(xì)胞，其中抗原特異性CD8<'+>記憶性T細(xì)胞所占的比例高于CD4<'+>記憶性T細(xì)胞，在非淋巴器官中的分布尤為顯著。最近的研究指出，記憶性T細(xì)胞表達(dá)CD127對(duì)于其長(zhǎng)期存活具有十分重要的意義。本實(shí)驗(yàn)中，疫苗誘導(dǎo)Gag-特異性記憶T細(xì)胞的主要表型為CD62L<'->C

8、D127<'+>，屬于效應(yīng)型記憶T細(xì)胞，它們?cè)诿庖邞?yīng)答的晚期主要存在于非淋巴器官，提供迅速的保護(hù)作用。 不同抗原特異性的免疫記憶在體內(nèi)維持的時(shí)間長(zhǎng)短不一。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HIVgagDNA疫苗誘導(dǎo)的Gag抗原特異性T細(xì)胞免疫記憶至少可以維持16周。如何延長(zhǎng)疫苗誘導(dǎo)免疫記憶的維持時(shí)間，有賴于進(jìn)一步的研究。 理想的艾滋病疫苗不但要在人體內(nèi)誘導(dǎo)足夠強(qiáng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答，同時(shí)也要誘導(dǎo)出體液免疫應(yīng)答，才能從不同途徑阻止HIV在體內(nèi)復(fù)制。

9、為了全面評(píng)價(jià)HIV gagDNA疫苗的作用，我們還利用間接ELISA技術(shù)對(duì)不同免疫組小鼠的血清進(jìn)行了抗原特異性抗體IgG的檢測(cè)。末次免疫1周及5周后的ELISA結(jié)果提示，與初次免疫相比，加強(qiáng)免疫HIV gag DNA疫苗能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生更高水平、個(gè)體差異更小的Gag-特異性IgG，進(jìn)一步鞏固了我們對(duì)“初免+加強(qiáng)"免疫方式的信心。通過(guò)對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，我們發(fā)現(xiàn)，加強(qiáng)免疫HIV gag DNA疫苗誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答可以長(zhǎng)期維持。至少