1、現(xiàn)有對冠狀病毒科的研究顯示,該科病毒擁有相對復(fù)雜的基因組結(jié)構(gòu)(29~31kb),含有多個獨立基因.病毒粒子包含3-4種結(jié)構(gòu)蛋白.SARS-CoV病毒的結(jié)構(gòu)蛋白主要有S、M、E、N 4種.其中S、M和E作為膜結(jié)合型結(jié)構(gòu)蛋白,由于相對暴露于病毒分子表面,可作為主要的疫苗設(shè)計靶點.我們通過數(shù)據(jù)庫結(jié)合軟件分析的方法,選擇了位于該病毒膜蛋白非保守區(qū)的多個表位,構(gòu)建了多抗原表位融合的SARS-CoV基因疫苗.該多抗原表位融合蛋白首先被證明可在原核和

2、真核細(xì)胞內(nèi)有效表達;進而,基因免疫和基因蛋白復(fù)合免疫表明,該疫苗可誘導(dǎo)有效的體液免疫反應(yīng)及相應(yīng)的細(xì)胞免疫應(yīng)答;所誘導(dǎo)的抗血清可特異性的結(jié)合真核或原核表達的病毒蛋白及病毒裂解液中相應(yīng)蛋白;中和試驗表明,抗血清可一定程度的控制病毒感染造成的細(xì)胞病變水平.1.基于多抗原表位的SARS-CoV基因疫苗的分子設(shè)計:由于S、M蛋白是SARS冠狀病毒的主要膜結(jié)構(gòu)蛋白,在該病毒感染過程中起關(guān)鍵作用,因此,我們將這兩個蛋白作為分析的靶蛋白.通過BLAST

3、網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫分析該病毒的S基因全長序列表明S蛋白1-217aa及425-513aa為該病毒特異的非保守區(qū),運用DNAstar生物軟件分析,通過可及性、抗原性等參數(shù)的分析,結(jié)合已有的研究成果,進一步選擇各類參數(shù)均較好的結(jié)構(gòu)區(qū)域作為候選疫苗表位區(qū)段;通過網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫分析確定這些區(qū)段中可能存在的T細(xì)胞抗原表位;最后結(jié)合上述數(shù)據(jù),預(yù)測同時具有T,B細(xì)胞表位的理想短肽為疫苗表位.分析現(xiàn)有的各種連接序列,并優(yōu)化串聯(lián)順序,獲得基于表位的SARS-CoV多

4、價疫苗的氨基酸設(shè)計序列.為了增強基因疫苗載體內(nèi)的表達效果,我們又對相應(yīng)基因的密碼子進行了優(yōu)化,使之適于在真核細(xì)胞內(nèi)表達,從而最終獲得基于表位的SARS-CoV基因疫苗的核酸設(shè)計序列.2.多抗原表位SARS-CoV疫苗的原核表達及其免疫原性研究:為了解該多抗原表位融合分子的免疫原性,研究該融合分子在原核表達系統(tǒng)的表達效率并獲得檢測用蛋白,我們將體外合成和構(gòu)建的多表位串聯(lián)基因片段接入pET-32a,結(jié)果表明,該多抗原表位串聯(lián)基因可在原核細(xì)胞

5、內(nèi)高效表達.以所得蛋白混合完全弗氏佐劑免疫小鼠,三周左右即可檢測到特異性抗體的產(chǎn)生.3.多抗原表位SARS-CoV基因疫苗的構(gòu)建及其誘導(dǎo)的特異性免疫應(yīng)答:將該多抗原表位串聯(lián)基因片段接入pcDNA4-his/myc載體,研究該設(shè)計基因的真核表達特性.pcDNA4-his/myc-epis轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后,Western-blot和免疫熒光檢測證明,該融合表位蛋白可在真核細(xì)胞內(nèi)有效表達;體內(nèi)肌注該質(zhì)粒36h后也可觀察到體內(nèi)多表位融合分子的

6、產(chǎn)生,這表明該多抗原表位串聯(lián)分子可用于進一步的基因疫苗研制.4.多抗原表位SARS-CoV基因疫苗抗病毒特性的研究:多抗原表位的SARS-CoV疫苗誘導(dǎo)的抗血清對真核、原核和病毒裂解液的雜交試驗表明,該疫苗可同時誘生針對SARS-CoV結(jié)構(gòu)蛋白M、S特異的抗體.中和試驗表明,抗血清可以一定程度的控制病毒感染的細(xì)胞病變水平,維持細(xì)胞形態(tài),抑制細(xì)胞死亡.該研究通過網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫比對結(jié)合軟件分析,設(shè)計了對應(yīng)的多抗原表位融合的新型候選疫苗.通過基因