1、目的: 探討B(tài)DNF基因轉(zhuǎn)染大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞BDNFmRNA、BDNF蛋白表達(dá)情況以及轉(zhuǎn)染基因?qū)ζ浞只挠绊?。評(píng)價(jià)對(duì)大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行BDNF基因轉(zhuǎn)染的可行性。 方法: 1、細(xì)胞培養(yǎng)：采用密度梯度離心法分離出大鼠BMSCs，在DMEM培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)擴(kuò)增； 2、細(xì)胞分組：將第三代BMSCs以1×106個(gè)/L的密度接種到6孔板。在細(xì)胞生長(zhǎng)至80％融合時(shí)，隨機(jī)分成未轉(zhuǎn)染組、空載體轉(zhuǎn)染組、BDNF轉(zhuǎn)染組，每組4孔。

2、 3、基因轉(zhuǎn)染：BDNF轉(zhuǎn)染組按標(biāo)準(zhǔn)方法以2μg PcDNA3.1-BDNF:6μl陽(yáng)離子聚合物轉(zhuǎn)染細(xì)胞；空載體轉(zhuǎn)染組以2μg PcDNA3.1:6μl陽(yáng)離子聚臺(tái)物轉(zhuǎn)染細(xì)胞；未轉(zhuǎn)染組繼續(xù)在原培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。 4、BDNF蛋白表達(dá)測(cè)定：轉(zhuǎn)染后24h，進(jìn)行BDNF免疫細(xì)胞化學(xué)染色，光學(xué)顯微鏡計(jì)數(shù)BDNF染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。 5、BDNFmRNA表達(dá)檢測(cè)：轉(zhuǎn)染后24h，各組BMSCs利用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶

3、鏈反應(yīng)(reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測(cè)BDNF mRNA的表達(dá)。 6、BDNF蛋白表達(dá)時(shí)效性測(cè)定：分別在轉(zhuǎn)染后1、3、5、7、9、11、13、15d收集培養(yǎng)液上清，利用ELISA檢測(cè)培養(yǎng)液上清中BDNF蛋白含量。 7、BMSCs分化鑒定：轉(zhuǎn)染后15d，進(jìn)行NSE和GFAP免疫細(xì)胞化學(xué)染色，光學(xué)顯微鏡計(jì)數(shù)NSE和GFAP染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，結(jié)果

4、用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。 8、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)。 結(jié)果: 采用密度梯度離心法成功分離出BMSCs，并在體外大量擴(kuò)增培養(yǎng)；轉(zhuǎn)染后24h，BDNF轉(zhuǎn)染組有大量BDNF染色陽(yáng)性細(xì)胞，未轉(zhuǎn)染組和空載體轉(zhuǎn)染組BDNF染色陽(yáng)性細(xì)胞極少，與BDNF轉(zhuǎn)染組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。未轉(zhuǎn)染組和空載體轉(zhuǎn)染組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)：三組細(xì)胞RT-PCR均擴(kuò)增出了約780bp的基因片段，條帶光密度BDNF轉(zhuǎn)染組高于未轉(zhuǎn)染組和空

5、載體轉(zhuǎn)染組(P<0.01)，未轉(zhuǎn)染組和空載體轉(zhuǎn)染組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；BDNF轉(zhuǎn)染組在轉(zhuǎn)染1d后BDNF蛋白即開(kāi)始表達(dá)，5～9d升高趨勢(shì)明顯，11～15d升高趨勢(shì)減緩，但BDNF蛋白表達(dá)量能夠維持在較高水平。未轉(zhuǎn)染組和空載體轉(zhuǎn)染組也表現(xiàn)出隨著時(shí)間變化，BDNF蛋白表達(dá)量升高趨勢(shì)。但在各時(shí)間點(diǎn)BDNF蛋白表達(dá)量均明顯低于BDNF轉(zhuǎn)染組(配對(duì)t檢驗(yàn)，P<0.01)。未轉(zhuǎn)染組和空載體轉(zhuǎn)染組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；轉(zhuǎn)