1、環(huán)核苷酸磷酸二酯酶八型(PDE8)是環(huán)核苷酸磷酸二酯酶家族中cAMP底物特異性的同工酶之一，在多種生理過(guò)程中起重要作用，并與腎上腺皮質(zhì)增生等疾病有關(guān)。由于大量制備純化PDE8十分困難，目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道PDE8催化結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)。為了深入揭示PDE8的催化水解機(jī)理及其與抑制劑之間的相互作用，本文經(jīng)過(guò)系統(tǒng)性研究，首次成功地在E.coli中過(guò)表達(dá)出變性PDE8A1催化結(jié)構(gòu)域片段(氨基酸序列480-820)，并用直接稀釋法復(fù)性，得到大量高活性

2、、純度大于95％的PDE8A1(480-820)；用酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)表征復(fù)性出的PDE8A催化結(jié)構(gòu)域片段；獲得了三個(gè)蛋白質(zhì)晶體并通過(guò)X射線衍射測(cè)定其結(jié)構(gòu)。三個(gè)蛋白質(zhì)晶體及其分辨率分別為：PDE8A1(480-820)晶體(分辨率為1.9A)、PDE8A1(480-820)-IBMX復(fù)合物晶體(分辨率為2.1A)、PDE8A1(480-820)-Dipyridamole復(fù)合物晶體(分辨率為1.95A)。 通過(guò)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)對(duì)復(fù)性PD

3、E8A1(480-820)進(jìn)行表征，發(fā)現(xiàn)以cAMP為底物，在含有10mMMgCl2的緩沖液中，復(fù)性PDE8A1(480-820)的KM為7.0±0.1μM，kcat為2.9±0.1s-1；在含有4mMMnCl2的緩沖液中，其KM為1.8±0.1μM，kcat為4.0±0.1s-1。復(fù)性PDE8A1(480-820)與文獻(xiàn)報(bào)道全長(zhǎng)PDE8A1相比，其KM為后者的7-45倍。用同樣的方法復(fù)性PDE8A1(205-820)并測(cè)得其KM為0.2

4、8μM，因此推測(cè)PDE8A1的N端PAS結(jié)構(gòu)域可能對(duì)PDE8A1的催化活性起調(diào)節(jié)作用。本文還測(cè)定了IBMX和Dipyridamole對(duì)復(fù)性PDE8A1(480-820)的IC50分別為698±29μM和6.0±0.4μM。 從晶體結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)：PDE8A1催化結(jié)構(gòu)域由18個(gè)α螺旋組成，并含有兩個(gè)金屬離子，其整體結(jié)構(gòu)與其它已知的PDE同工酶催化結(jié)構(gòu)域極為相似。本文由復(fù)性PDE8A1(480-820)的結(jié)構(gòu)出發(fā)，結(jié)合酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究

5、和已有的文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)PDE8A1催化結(jié)構(gòu)域的催化水解機(jī)理進(jìn)行了推測(cè)。與其它已知的PDE同工酶催化結(jié)構(gòu)域晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)PDE8A1Gln778的構(gòu)象未直接被其它氨基酸殘基所固定，而是分別通過(guò)兩個(gè)水分子與Ser745和Trp813連接，其構(gòu)象比其它PDE同工酶中相應(yīng)位置的谷氨酰胺殘基的自由度高，并且在不同條件下Gln778的構(gòu)象可能有所差異。本文還詳細(xì)研究了復(fù)性PDE8A1(480-820)與IBMX的相互作用。結(jié)果表明Tyr748